本发明专利技术涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的甲醛测定试剂(盒),同时本发明专利技术还涉及测定甲醛浓度的方法、试剂的组成及成分,属于食品/环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂(盒)主要成分包括:缓冲液、辅酶、腺苷三磷酸、四氢叶酸、甘油醛-3-磷酸、甲醛脱氢酶、甲酸-四氢叶酸连接酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度上升的程度,从而测算出甲醛的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种甲醛测定试剂(盒),同时本专利技术还涉及测定甲醛浓度的方法,属于食品/环境检验测定
技术介绍
甲醛测定的测定方法主要有分光光度法、色谱法、电化学法、化学滴定法等 分光光度法测定的主要方法有乙酰丙酮法、铬变酸法、MBTH法、付品红法、AHMT法 等几种。分光光度法的优点是操作简便;;缺点是灵敏度较低,有污染介质,对测定有干扰。 色谱法主要有气相色谱、高效液相色谱法、离子色谱法等,直接利用色谱法较少, 一般是和其它分析仪器相连用,如GC-MS、HPLC-UV等。色谱法方法简单、快速、直接,但是操 作繁琐、试剂消耗量大、方法选择性差等缺点。 电化学法包括示波极谱法、吸附伏安法和哥腊衍生试剂法,该法空气中甲醛的灵 敏度和准确度都很高,适合于测定室内空气中微量甲醛。 荧光分析法因具有快速、简便、灵敏度高、重现性好等优点而受到人们广泛的重视,尤其是用于室内空气环境中痕量甲醛的分析监测,其优点更为突出。化学发光分析法具有灵敏度高,线性范围宽,仪器设备简单等优点。 化学滴定法主要包括电位滴定法、碘量法及酸碱滴定法。 综合上述,没有一个方法可以使用自动化仪器检测甲醛的,酶法检测甲醛的试剂, 酶法的优点是特异性高不受干扰、操作方便、成本低廉、可以大批量检测,方法灵敏。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出 一 种利用酶倍增法(EnzymaticDoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术,计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化,得以测定甲醛浓度的方法,同时,本专利技术还将给出用以实现该方法的甲醛测定试剂(盒),采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甲醛浓度测定,而且测定速度快、准确度高,因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术甲醛浓度测定方法如下 甲醛+辅酶+水甲醛脱氡酶甲酸+还原型辅酶 甲酸+腺苷三磷酸+四氢叶酸甲酸-四氡叶酸连接酶腺苷二磷酸+磷酸根 +10-甲酰四氢叶酸 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氡酶甘油酸-1, 3-双磷酸+ 还原型辅酶 这种方法应用甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase^ 1. 2. 1. 46)酶 (偶)联甲酸_四氢叶酸连接酶(formate-tetrahydrofolate ligase ;EC 6. 3. 4. 3)、甘油 醛_3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 59)酶促反应比色终点法。甲醛脱氢酶酶解甲醛反应产生甲酸,再通过(偶)联合甲酸-四氢叶酸连 接酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为 还原型辅酶(在340nm处有吸收峰),从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程 度,通过测量340nm处吸光度上升的程度,可以测算甲醛的浓度大小。 实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是单 剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本专利技术甲醛测定试剂(盒)较为理想缓冲液100,1/L稳定剂500,1/L辅酶3mmol/L甲醛脱氢酶10000U/L甲酸_四氢叶酸连接酶12000U/L甘油醛_3-磷酸脱氢酶12000U/L腺苷三磷酸4mmol/L四氢叶酸4mmol/L甘油醛_3-磷酸12mmol/L本专利技术的甲醛测定试剂(盒)可以是单剂,包括缓冲液、稳定剂、辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸--四氢叶酸连接酶、甘油醛_3-磷酸脱氢酶、腺苷」三磷酸、四氢叶酸、甘油醛_3-磷酸。试剂(盒)可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使斥 也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、四氢叶酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2 缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶、甲酸_四氢叶酸连接酶、甘油醛_3-磷酸脱氢酶。 辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸_四氢叶酸连接酶、甘油醛_3-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸、 四氢叶酸、甘油醛-3-磷酸在试剂l或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉 状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、四氢叶酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2 缓冲液、稳定剂、甲酸_四氢叶酸连接酶、甘油醛_3-磷酸脱氢酶。 试剂3 缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶。 辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸_四氢叶酸连接酶、甘油醛_3-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸、 四氢叶酸、甘油醛-3-磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以 是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂,本专利技术测定甲醛浓度的方法,其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio- NAD+中的一种。 具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的甲醛测定试剂为单试剂,包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3mmol/L 甲醛脱氢酶 10000U/L 甲酸-四氢叶酸连接酶 12000U/L 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000U/L 腺苷三磷酸 4mmol/L 四氢叶酸 4mmol/L 甘油醛-3-磷酸 12mmol/L 试剂全部溶解配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;使用前,加入纯净 水,复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:,反应时间10分钟,起始吸光度《0. l,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测甲醛样品与试剂的体积比例为1/25,反应方向为正反应(上升反应),延迟时间大约0分钟左右,检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度,从而测算出甲醛的浓度大小。 实施例二 本实施例的甲醛测定试剂为双试剂,包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3mmol/L 腺苷三磷酸 4mmol/L 四氢叶酸 4mmol/L 甘油醛-3-磷酸 12mmol/L 试剂2 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 甲醛脱氢酶 10000U/L 甲酸-四氢叶酸连接酶 12000U/L 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000U/L 试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:,反应时间10分钟,起始吸光度《0. l,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测甲醛样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5, 反应方向为正反应(上升反应),延迟时间大约0分钟左右,检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测 主波长340nm吸光度上升的程度,从而测算出甲醛的浓度大小。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的甲醛的浓度测定方法,其方法如下: 甲醛+辅酶+水 甲醛脱氢酶 甲酸+还原型辅酶 甲酸+腺苷三磷酸+四氢叶酸 甲酸-四氢叶酸连接酶 腺苷二磷酸+磷酸根+10-甲酰四氢叶酸 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶 甘油酸-1,3-双磷酸+还原型辅酶 将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度,测算出甲醛的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:王尔中,
申请(专利权)人:苏州艾杰生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:32[中国|江苏]
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