乳糖诊断／测定试剂（盒）及乳糖浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定乳糖浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、磷酸根、乳糖酶、葡萄糖－６－磷酸酶、葡萄糖－６－磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定

技术介绍
乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳 清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。 牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影B向。很多人在 饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐 受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠 中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受的人还有 大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为 95%-100%。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3_13岁儿童乳糖不耐受 症和乳糖吸收不良的发生率约为80%。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营 养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引 发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑 发育，对人体健康危害很大。 在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的 一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实 现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇 类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现 该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。 本专利技术乳糖浓度测定方法如下 乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+磷酸根葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸+水 葡萄糖-6-磷酸+辅酶葡萄糖-e-磷酸脱氡酶葡糖酸内酯磷酸+3 还原型辅酶 这种方法应用乳糖酶(lactase ;EC 3. 2. 1. 108)酶(偶)联葡萄糖_6_磷酸酶 (glucose-6-phosphatase ;EC 3. 1. 3. 9)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatel-dehydrogenase ;EC 1. 1. 1.49)酶促反应比色终点法。乳糖酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再 通过(偶)联合葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm 处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算乳糖的浓度大 小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3mmol/L 磷酸根 5mmol/L 乳糖酶 10000U/L 葡萄糖-6-磷酸酶 12000U/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 12000U/L 本专利技术的乳糖诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸根、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸根。 试剂2 缓冲液、稳定剂、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖_6-磷酸脱氢酶。 辅酶、磷酸根、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l 缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸根。 试剂2 缓冲液、稳定剂、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖_6-磷酸脱氢酶。 试剂3 缓冲液、稳定剂、乳糖酶。 辅酶、磷酸根、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂l、试剂2 或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定乳糖浓度的方法，其辅酶、磷酸根可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3mmol/L 磷酸根 5mmol/L 乳糖酶 10000U/L 葡萄糖-6-磷酸酶 12000U/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 12000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 实施例二 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3mmol/L 磷酸根 5mmol/L 试剂2 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 乳糖酶 10000U/L 葡萄糖-6-磷酸酶 12000U/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 12000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0. 1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 实施例三 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 50mmol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法的乳糖的浓度测定方法，其方法如下：　　乳糖＋水　乳糖酶　半乳糖＋葡萄糖　　葡萄糖＋磷酸根　葡萄糖－６－磷酸酶　葡萄糖－６－磷酸＋水　　葡萄糖－６－磷酸＋辅酶　葡萄糖－６－磷酸脱氧酶　葡糖酸内酯磷酸＋还原型辅酶　　将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出乳糖的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]