本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定乳糖浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、鸟苷二磷酸、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、ＮＡＤＨ过氧化物酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定
技术介绍
乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳 清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。 牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影B向。很多人在 饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐 受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠 中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受的人还有 大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为 95%-100%。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3_13岁儿童乳糖不耐受 症和乳糖吸收不良的发生率约为80%。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营 养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引 发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑 发育，对人体健康危害很大。 在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的 一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实 现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇 类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现 该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。 本专利技术乳糖浓度测定方法如下 乳糖+尿苷二磷酸乳糖合成酶尿苷二磷酸_半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸内酯+过氧化氢 过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+2水 这种方法应用乳糖合成酶(lactose synthase ;EC 2. 4. 1. 22)酶(偶)联葡 萄糖氧化酶(Glucose Oxidase ;EC 1. 1. 3. 4) 、 NADH过氧化物酶(NADH peroxidase ;EC 1. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反应比色终点法。乳糖合成酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再 通过(偶)联合葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处 有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处 吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算乳糖的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定乳糖浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。 具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0. 25mmol/L 乳糖合成酶 6000U/L 葡萄糖氧化酶 8000U/L NADH过氧化物酶 10000U/L 鸟苷二磷酸 6mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 实施例二 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 50mmol/L 还原型辅酶 0. 25mmol/L 鸟苷二磷酸 6mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 乳糖合成酶 6000U/L 葡萄糖氧化酶 8000U/L NADH过氧化物酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1 、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 实施例三本实施例的乳糖诊断/; 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷稳定剂还原型辅酶鸟苷二磷酸试剂2三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂葡萄糖氧化酶 NADH过氧化物酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂 乳糖合成酶J定试剂为三试剂，包括盐酸缓冲液盐酸缓冲液100,1/ 50mmol/L 0. 25,1/L 6mmol/L100,1/ 500,1/L 8000U/L 10000U/L盐酸缓冲液100,1/L 500,1/L 6000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定乳糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始 吸光度1. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1、试剂2、试 剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右， 检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上
技术实现思路
中记载的其他测定方法均能达到本专利技术 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本专利技术的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度时间反应曲线应呈下 降曲线直至终点；试剂可测有效(R 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖浓度测定方法，其方法如下： 乳糖＋尿苷二磷酸 乳糖合成酶 尿苷二磷酸－半乳糖＋葡萄糖 葡萄糖＋氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸内酯＋过氧化氢 过氧化氢＋还原型辅酶 ＮＡＤＨ过氧化物酶 辅酶＋２水 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出乳糖的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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