组织型纤溶酶原激活物环饼结构－２对脑卒中的治疗作用及制备方法技术

本发明专利技术涉及医药生物工程技术领域，包括组织型纤溶酶原激活物环饼结构－２多肽的制备及应用。本发明专利技术使用两种方法制备组织型纤溶酶原激活物环饼结构－２。方法一，人源组织型纤溶酶原激活物变体瑞替普酶（ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）作为原料，使用纤溶酶原（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）切割瑞替普酶（ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）得到由二硫键连接的环饼结构－２（ｋｒｉｎｇｌｅ－２）和碳端丝氨酸蛋白酶组成的多肽。使用β－巯基乙醇限制性还原断裂二硫键，Ｈ２Ｏ２限制性氧化。用ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ?４Ｂ亲和层析进一步纯化环饼结构－２多肽。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检验蛋白纯度。方法二，利用ＰＣＲ技术获得环饼结构－２基因，将其克隆至具有Ｔ７启动子的表达质粒ｐＥＴ２９ａ中。重组质粒转化至大肠杆菌ＢＬ２１中，经ＩＰＴＧ诱导表达，其产物以包涵体形式存在，通过体外复性，得到可溶性的环饼结构－２。在脑缺血后给予环饼结构－２，可降低脑卒中大鼠死亡率；减少脑梗死体积；降低内源ｔＰＡ的表达；调节ＢＢＢ开放模式，使得ＢＢＢ在脑缺血后２４小时ＢＢＢ通透性降低，有效的防止了脑水肿发生；减少脑神经元凋亡。组织型纤溶酶原激活物环饼结构－２多肽主要用于脑卒中的治疗，也可用于脑损伤以及神经退行性病的神经保护。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
环饼结构－２多肽（Ｋｒｉｎｇｌｅ２）制备方法在于：　　２ｍｇ／ｍＬ　ｒｅｔｅｐｌａｓｅ与２μｇ／ｍＬ人源ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ在ｄｉｇｅｓｔ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ，０．７ｍｏｌ／ＬＡｒｇ，ｐＨ８．０）中３７℃酶切过夜。反应混合物在室温用β－巯基乙醇（５ｍｍｏｌ／Ｌ）限制性还原２小时，然后用Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）室温氧化１小时，破坏ｋｒｉｎｇｌｅ２结构域与Ｐ结构域之间的二硫键。用ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｃｏｌｕｍｎ进一步纯化Ｋｒｉｎｇｌｅ２多肽。所得Ｋｒｉｎｇｌｅ２多肽对１００ｍＭＰＢＳ透析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检验蛋白纯度。脑缺血后脑室注射ｋｒｉｎｇｌｅ２用于脑缺血后脑保护。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建宁，张菁，张海涛，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]