检测核酸酶的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了检测外切核酸酶的方法，该方法包括：将核酸与待检测样品接触，所述核酸携带荧光基团，所述荧光基团不影响所述外切核酸酶的活性；确定所述接触前和所述接触后所述核酸的性状，以便确定所述待检测样品中的所述外切核酸酶。利用本发明专利技术的方法可以高效准确地检测待检测样品中是否含有外切核酸酶，并且该方法具有高灵敏性、检测速度快、成本低、实验步骤简单等特点。简单等特点。

【技术实现步骤摘要】
检测核酸酶的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及检测核酸酶的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]外切酶是参与水解反应的DNA核酸酶，它能打破多核苷酸链末端的磷酸二酯键，并一次裂解一个核苷酸。外切酶家族涉及细胞代谢和生理过程的维持，帮助DNA校对和维持基因组的稳定性。
[0003]外切酶III(Exo III)属于外切酶家族，具有3'至5'
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端外切酶活性，不需要任何特异性识别点。当底物凹陷或变钝时，Exo III通过逐步去除DNA 3'
‑
OH末端的单核苷，3'
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末端在单链DNA或带有突出的3'
‑
末端的双DNA上表现出较低的活性。在DNA复制过程中，Exo III具备了DNA校对、刺激基因重组反应、修复DNA断裂的必要能力，承担了DNA复制过程的精确性，保持了细胞内突变率。研究表明，3'至5'端外切酶的过表达和低表达不足会导致细胞传递不准确的转录和误导翻译，进而增加癌变的风险，尤其是在长期压力下。同时，在大肠杆菌表达系统中，Exo III是蛋白的表达与纯化中一种常见的核酸酶污染。
[0004]因此，对Exo III的检测研究具有重要意义，它们可能被用作疾病的检测工具以及蛋白核酸酶污染检测。
[0005]毫无疑问，开发一种高效的分析方法，能够快速、准确地测定复杂生物环境下中3
’→
5外切酶的活性是十分迫切的。

技术实现思路

[0006]专利技术人发现，3<br/>′
至5
′
方向外切酶活性检测的常规方法是基于凝胶电泳和放射性标记DNA探针。这些传统方法的特点是耗时、繁琐、固有的安全问题和较高的成本。近年，对3
’→5’
外切酶活性的生物感应系统进行了大量的研究。例如，一种基于K+诱导g四倍形和ThT染色的无标签检测Exo III的DNA发卡探针方法具有简单、成本低的优点。基于氧化石墨烯的荧光检测装置促进了Exo III低的检测限制为0.01U。Tb 3+诱导的g四联偶联物形成了一种快速且无标记的荧光“打开”实验，用于体外检测。SYBR Green I与DNA的相互作用激发了一种实时监测3
’→5’
外切酶的新方法。再如，利用氧化石墨烯和溴化乙二胺之间的远程共振能量转移原理，开发的一种简单的无标签荧光测定法来测定DNA外切酶活性。第三，多外切酶检测方法由三色荧光探针创建，可作为多外切酶或限制内切酶检测同步的DNA分子。然而，专利技术人发现上述技术显示了一个或多个缺点，如不敏感、耗时或不经济。
[0007]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种检测外切核酸酶的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将核酸与待检测样品接触，所述核酸携带荧光基团，所述荧光基团不影响所述外切核酸酶的活性；确定所述接触前和所述接触后所述核酸的性状，以便确定所述待检测样品中的所述外切核酸酶。根据本专利技术的实施例，利用携带荧光基团的核酸对所述待检测样品进行检测，可以高效准确地确定所述待检测样品中是否含有外切核酸酶，同时，还可以确定所述
外切核酸酶的酶活以及动力学特性。
[0008]根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0009]根据本专利技术的实施例，所述核酸设置于测序芯片上。根据本专利技术的实施例，核酸设置于测序芯片上便于对上述核酸进行测序，获取核酸的序列、长度等信息。此外，配置有核酸的测序芯片还可以直接使用进行高通量测序后的下机芯片，进一步减少资源浪费，对测序后的下机芯片进行再利用，可同时降低测序、外切核酸酶检测的成本。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述核酸是以DNA纳米阵列的形式存在的。根据本专利技术实施例的方法，基于纳米阵列测序技术对核酸的性质(核酸与待检测样品接触前和接触后)进行检测，可以有较高的敏感性及检测速度。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述接触是在37℃条件下进行的，接触时间至少为10min。由此，在37℃、且接触时间大于等于10min，可通过测序仪系统检测接触后底物芯片上核酸携带的荧光强度。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述核酸的性状包括选自荧光强度、ESR、链长的至少之一。根据本专利技术实施例的方法，通过检测核酸与待检测样品接触前和接触后的荧光强度、荧光有无、ESR(又称有效DNB率)、核酸的链长等性质，可以有效确定外切核酸酶的有无、酶活及动力学特性。
[0013]根据本专利技术的实施例，将所述核酸与所述待检测样品接触前后进行测序反应。根据本专利技术的实施例，基于测序，获取核酸与待检测样品接触前后的序列信息，并进行比对，通过接触前与接触后核酸序列的差异，包括序列的长度差异等，判断待检测样品中是否含有目的外切核酸酶，结合接触的时间，可以进一步获得待检测样品中外切核酸酶的酶活以及动力学特性等。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述测序反应包括选自二代测序和纳米孔测序的至少之一。根据本专利技术的实施例，所述测序反应不受特殊限制，可以基于芯片进行的测序反应均可。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括：各自独立地确定所述接触前所述核酸的荧光强度和接触后所述核酸的荧光强度，以便确定所述待检测样品中是否含有所述外切核酸酶，当所述接触后所述芯片荧光强度小于所述接触前所述芯片荧光强度时，是所述待检测样品中含有所述外切核酸酶的指示。根据本专利技术的实施例，所述核酸的每一个核苷酸上均携带荧光基团，获取接触前和接触后的核酸的荧光强度，并进行比对，根据接触前和接触后核酸的荧光强度差异判断待检测样品中是否含有目标外切核酸酶。
[0016]根据本专利技术的实施例，进一步包括：各自独立地确定所述接触前底物芯片上核酸的ESR和所述接触后底物芯片上核酸的ESR，以便确定所述样品中是否含有所述外切核酸酶，当接触前ESR大于接触后ESR时，是所述待检测样品中含有所述外切核酸酶的指示。根据本专利技术的实施例，基于纳米阵列测序及其芯片进行外切核酸酶的检测，DNB(DNA nanoball，DNA纳米阵列)是由Phi29聚合酶进行滚动环复制制备的单链DNA片段测序底物的共价串联拷贝数，DNB被固定在芯片的表面，该测序芯片表面含有规则的位点，每个位点只结合一个DNB。检测接触前与接触后的ESR，当待检测样品中含有所述外切核酸酶，DNA纳米阵列的核酸中的核苷酸被切除，破坏DNA纳米阵列，使ESR变低，由此可以判断待检测样品中是否含有外切核酸酶。
[0017]根据本专利技术的实施例，当所述样品中含有所述外切核酸酶时，基于所述接触后ESR与接触前ESR的比值确定所述外切核酸酶的酶活。根据本专利技术的实施例，酶活(ESR Ratio)＝核酸酶反应后所检测到的有效DNB率(ESR2)/核酸酶反应前所检测到的有效DNB率(ESR1)*100，基于接触前、后核酸的ESR，可以准确获得待检测样品中外切核酸酶的消化速度。
[0018]根据本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测外切核酸酶的方法，其特征在于，包括：将核酸与待检测样品接触，所述核酸携带荧光基团，所述荧光基团不影响所述外切核酸酶的活性；确定所述接触前和所述接触后所述核酸的性状，以便确定所述待检测样品中的所述外切核酸酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸设置于测序芯片上。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸是以DNA纳米阵列的形式存在的。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述接触是在37℃条件下进行的，接触时间至少为10min。5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸的性状包括选自荧光强度、ESR、链长的至少之一。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述核酸与所述待检测样品接触前后进行测序反应；任选地，所述测序反应包括选自二代测序和纳米孔测序的至少之一。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：各自独立地确定所述接触前所述核酸的荧光强度和接触后所述核酸的荧光强度，以便确定所述待检测样品中是否含有所述外切核酸酶；当所述接触后所述核酸荧光强度小于所述接触前所述核酸荧光强度时，是所述待检测样品中含有所述外切核酸酶的指示。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：各自独立地确定所述接触前所述芯片上所述核酸的ESR和所述接触后所述芯片上所述核酸的ESR，以便确定所述样品中是否含有所述外切核酸酶；当接触前ESR大于接触后ESR时，是所述待检测样品中含有所述外切核酸酶的指示。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述样品中含有所述外切核酸酶时，基于所述接触后ESR与接触前ESR的比值确定所述外切核酸酶的酶活。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酶活的检测下限为0.0025U/mL。11.根据权利要求5所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈莹，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：