本发明专利技术是一种来自海洋的链霉菌ＢＭ－２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＢＭ－２）的分离培养方法，其特征在于，其步骤如下：它包括富集培养、菌体的分离纯化、菌株的筛选和菌株的鉴定等步骤，根据形态学、生理生化试验结果以及１６ＳｒＤＮＡ的同源性分析表明分离培养的菌株为链霉菌ＢＭ－２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＢＭ－２）。该链霉菌ＢＭ－２具有抑制多种植物病原真菌及抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种菌种的培养方法，特别是一种来自海洋的链霉菌BM-2 的分离培养方法；本专利技术还涉及链霉菌BM-2的用途。
技术介绍
许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途，已广泛用 作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物，现在已发现的数万种微生物来源的生物活 性物质中，约有70%是由放线菌所合成的。目前分离得到的绝大多数放线菌都 来源于土壤，陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的三分之二以上， 然而随着病原微生物对抗生素抗性的日益提高，寻找具有新型作用机制的抗 生素已迫在眉睫。近20年来，从陆生放线菌中分离得到的先导化合物的数量 锐减，于是人们把目光投向了更为广阔的生境-海洋。海洋放线菌的生活环境十分特殊，如高盐度，高压，低营养，低温及与不同生物之间的关系等。 在这些所谓生命的极限环境中，海洋放线菌已发展出独特的代谢方式，这不 仅确保其在极端环境中生存，也提供了产生新颖抗生素的潜力。因此，海洋 环境将成为放线菌和放线菌代谢产物的重要新来源。虽然海洋放线菌不是海洋微生物生态系统中的主要组成部分，但越来越多 的研究结果显示，其代谢产物具有独特性。来自国际著名的海洋天然产物研究机构加州大学的W.Fenical教授于2001年6月在日本举行的第10次国际海洋天4然产物研讨会上报道了他们的最新发现:他们首次发现并成功培养了一属海洋放线菌，命名为Mw/mw/ om.，这种菌只能在有盐的条件下生长，具有独特的 16SrRNA序列。对100株这种菌进行了抗菌及抗肿瘤活性筛选试验，结果有80% 的发酵液抽提物显示出明显的抗菌和抗肿瘤活性。对其中一株菌发酵液进行化 学研究，从中分离纯化出一系列结构新颖的化合物，命名为Salinosporamides，这些化合物具有很强的抗癌活性。许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途，己广泛用 作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物。据不完全统计，目前关于海洋放线菌活性 物质的研究已经引起人们的重视，从海洋环境中分离得到了多种产生新活性 物质的海洋放线菌，并对得到的菌株的发酵条件、生物活性以及活性物质的. 分离鉴定进行了研究，取得了可喜的成果，但己有的研究主要集中在医药的 开发上，而海洋放线菌对植物病原真菌的抗菌物质研究还刚刚起步，从海洋 环境中寻找具有新的抗菌机制的海洋放线菌应用于植物病害的生物防治对于 开发高效环保新型农药具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种对多种植 物病原真菌有强抗菌作用的链霉菌BM-2 (&印tomK" sp. BM-2)的分离培 养方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是 一种来自海洋的链霉菌BM-2 (&reptomyc" sp. BM-2)的分离培养方法，其 特点是，其步骤如下 (1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有50mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中， 190r/min， 25。C条件下摇床培养5天；(2) 菌体的分离纯化用移液枪取富集培养5天的培养液1.0mL加入到盛有 9.0mL无菌海水的试管中，制备成10—i的样品稀释液；然后采用梯度稀 释的方法连续稀释，分别制备成10—2、 10-3、 10-4、 10-5、 l(T、 10—7的样品 稀释液；然后分别取10—5、 10—6和10—7的样品稀释液0.2ml放到海水高氏l 号培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25'C的培养箱中培养，长 出菌落；再分别挑取海水高氏l号培养基平板上的菌落，用三区划线的 方法接种到海水高氏l号培养基平板上，置于25i:培养箱中培养，反复 划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到海水高 氏l号培养基试管斜面中保存；(3) 菌株的筛选采用平板对峙培养法，以供试的植物病原真菌小麦赤霉病 菌和棉花枯萎病菌为受试菌，分别测定分离纯化得到的不同菌株的抗植 物病原真菌活性；操作时在PDA培养基平板中央接种培养5d的植物病原 真菌，在植物病原真菌四周距培养皿壁15mm处对称划线接种分离纯化 得到的不同菌株，25"C倒置恒温培养，观察植物病原真菌菌落生长状况， 培养5d后测量抑菌带宽度；每个菌株为一处理，每处理重复3次；选取 一株对前述2种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于15mm的菌株，记 为BM-2菌株；(4) 菌株的鉴定将BM-2菌株于25"C下培养5天，观察记录菌落和细胞形 态，同时进行生理生化试验，并进行16SrDNA测序分析；根据形态学 和生理生化试验结果初步认为菌株BM-2属于链霉菌属；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5^e/ tom_yc" sp. ，二者的16SrDNA 序列相似性为99%， BM-2菌株为链霉菌(5^印tomyce!rsp.)。 以上所述的来自海洋的链霉菌BM-2 sp. BM-2)的分离培养方法技术方案中，所述的链霉菌BM-2菌株的优化发酵条件为最适培养 基为淀粉14g 、乳糖16g、黄豆粉16g 、磷酸氢二钾3g 、碳酸钙4g 、 氯化钾0.4g、氯化钠30g，水1000ml， pH为7.5;发酵条件为接种量7%， 装瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，摇床转速190r/min，最适温度28""C，培养时间 5d。本专利技术中所涉及的生物材料"链霉菌BM-2 (6^印to附yc" sp. BM-2)"菌 株己于2009年2月4日在Genebank公开(登录号为FJ595715，网址为 (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi7db二nuccore&id=222145980)。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众 如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。本专利技术所述的链霉菌BM-2 (5Vreptom_yc" sp. BM-2)具备抑制多种植物病原真菌的用途。以下是专利技术人所做的链霉菌BM-2 (&reptom少c" sp. BM-2)菌株(以下简称BM-2菌株)的相关试验。1、分离筛选试验。 1. 1培养基(1) 富集培养基酵母膏5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、 NaC15g、陈海水 1000mL， pH 7.5-8.0。(2) 海水高氏l号培养基可溶性淀粉20g， KN03 lg，氯化钠0.5g， 磷酸氢二钾0.5g， MgS04*7H20 0.5g， FeS04'H20 O.Olg，琼脂20g，海水1000mL， pH7.2 7,4。(3)PDA培养基马铃薯200g ，葡萄糖20g，琼脂20g,水1000mL， pH自然。1. 2供试病原菌玉米小斑病菌(丑—/鎖.a附ay血)、玉米圆斑病菌 (//e/脂'w^7aspor/wm car6owM附)、小麦赤霉病菌(F"S(3r/wm gra附/"earww)、棉花丰古萎病菌(Fwjan.ww o平/ or簡f.sp.vasinfectum)、小麦雪腐镰刀病菌(Fwsa"'簡m.va/e)、斑点落叶 病菌(兹m7fl〃'a a/femato)、小麦根腐病菌(5—/腦i 5WY^:/m'""a)、细链格本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自海洋的链霉菌ＢＭ－２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＢＭ－２）的分离培养方法，其特征在于，其步骤如下： （１）富集培养：从连云港海域采集海泥，将海泥１０ｇ放入盛有５０ｍＬ的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取５ｍＬ悬浮液加入到５０ ｍＬ富集培养液中，１９０ｒ／ｍｉｎ，２５℃条件下摇床培养５天； （２）菌体的分离纯化：用移液枪取富集培养５天的培养液１．０ｍＬ加入到盛有９．０ｍＬ无菌海水的试管中，制备成１０－１的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成 １０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７的样品稀释液；然后分别取１０－５、１０－６和１０－７的样品稀释液０．２ｍｌ放到海水高氏１号培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于２５℃的培养箱中培养，长出菌落；再分别挑取海水高氏１号培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到海水高氏１号培养基平板上，置于２５℃培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到海水高氏１号培养基试管斜面中保存； （３）菌株的筛选：采用平板对峙培养法，以供试的 植物病原真菌小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌为受试菌，分别测定分离纯化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作时在ＰＤＡ培养基平板中央接种培养５ｄ的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培养皿壁１５ｍｍ处对称划线接种分离纯化得到的不同菌株，２５℃倒置恒温培养，观察植物病原真菌菌落生长状况，培养５ｄ后测量抑菌带宽度；每个菌株为一处理，每处理重复３次；选取一株对前述２种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于１５ｍｍ的菌株，记为ＢＭ－２菌株； （４）菌株的鉴定：将ＢＭ－２菌株于２５℃下培养 ５天，观察记录菌落和细胞形态，同时进行生理生化试验，并进行１６ＳｒＤＮＡ测序分析；根据形态学和生理生化试验结果初步认为菌株ＢＭ－２属于链霉菌属；１６ＳｒＤＮＡ的同源性分析表明，ＢＭ－２菌株最接近于Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．，二者的１６ＳｒＤＮＡ序列相似性为９９％，ＢＭ－２菌株为链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马桂珍，暴增海，吴少杰，张晓君，王伟霞，李福后，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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