花青苷糖基转移酶和酰基转移酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了花青苷糖基转移酶和酰基转移酶及其编码基因和应用。糖基转移酶LrGT7、LrGT16、LrGT22的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示，酰基转移酶LrAT81的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明专利技术从黑果枸杞中克隆获得糖基转移酶基因LrGT71、LrGT16、LrGT22和酰基转移酶基因LrAT81，其编码的蛋白能催化花青苷的糖基化及酰基化生成比具有多个修饰基团的稳定花青苷，在稳定花青苷的体内体外生物合成中具有重要的应用价值，亦或对其他物种来源的糖基转移酶基因和酰基转移酶基因的筛选与鉴定具有参考作用和重要的意义。作用和重要的意义。作用和重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
花青苷糖基转移酶和酰基转移酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物
，具体涉及黑果枸杞花青苷糖基转移酶基因和酰基转移酶基因在具有多个修饰基团的稳定花青苷的生物合成中的应用。

技术介绍

[0002]花青苷(Anthocyanin)，又称为花色苷，是植物花朵或果实主要呈色物质之一，亦是植物生长抗逆等生理过程中的重要次生代谢产物。于人类而言，花青苷是兼具色素及保健功效的化合物，且花青苷属于水溶性化合物，毒性极小。因此，在食品色素添加剂或保健品等行业具有广阔的应用前景。
[0003]由于花青苷的结构特征，稳定性差是其在应用中最大的问题。虽然工业上可采用添加护色剂、浓缩等工艺维持花青苷的稳定性，但这也会增加成本。对花青苷的分子结构进行修饰改造以提高其稳定性是解决问题最为根本的办法。在分子结构修饰方面，糖基化修饰是最为重要的一步，且3位
‑
OH的糖基化是从不稳定花青素到稳定花青苷合成的第一步，也是后续其他修饰的先决条件；花青苷的酰基化则在糖基化的基础上进一步增加分子的稳定性。修饰基团能使花青苷更稳定的原因使形成了分子堆积，多个修饰的花青苷比单个修饰的又更为稳定。
[0004]因此，本专利技术利用黑果枸杞中的基因资源，可通过生物技术等手段合成具有多修饰基团的稳定花青苷，具有重要的经济价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供黑果枸杞的糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22和酰基转移酶LrAT81。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术措施：
[0007]提取黑果枸杞RNA，反转录为cDNA，以其为PCR模板，采用本专利技术中所述引物扩增得到SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，并将4个序列分别连接至pEASY载体，转化BL21(DE3)后表达获得重组蛋白，并利用纯化后的重组蛋白进行催化花青素合成花青素
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香豆酰芸香糖苷
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葡萄糖苷。
[0008]本专利技术的黑果枸杞LrGT71、LrGT16、LrGT22和LrAT81，其特征在于，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供编码上述LrGT71、LrGT16、LrGT22和LrAT81的基因。
[0010]所述的编码基因优选为LrGT71、LrGT16、LrGT22和LrAT81，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供上述糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22和/或酰基转移酶LrAT81在具有多个修饰基团的稳定花青苷生物合成中的应用。
[0012]优选，所述的生物合成是体内或体外。
[0013]优选，糖基转移酶LrGT71在催化花青素合成花青素
‑3‑
葡萄糖苷中的应用。
[0014]优选，糖基转移酶LrGT16在催化花青素
‑3‑
葡萄糖苷合成花青素3
‑
芸香糖苷中的应用。
[0015]优选，酰基转移酶LrAT81在催化花青素
‑3‑
芸香糖苷合成花青素
‑3‑
香豆酰芸香糖苷中的应用。
[0016]优选，糖基转移酶LrGT22在催化花青素
‑3‑
香豆酰芸香糖苷合成花青素
‑3‑
香豆酰芸香糖基
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葡萄糖苷中的应用。
[0017]优选，糖基转移酶LrGT71、LrGT16、酰基转移酶LrAT81、糖基转移酶LrGT22在共同催化花青素直接合成花青素
‑3‑
香豆酰芸香糖苷
‑5‑
葡萄糖苷中的应用。
[0018]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0019]本专利技术从黑果枸杞中克隆获得糖基转移酶基因LrGT71、LrGT16、LrGT22和酰基转移酶基因LrAT81，其编码的蛋白能催化花青苷的糖基化及酰基化生成比具有多个修饰基团的稳定花青苷，在稳定花青苷的体内体外生物合成中具有重要的应用价值，亦或对其他物种来源的糖基转移酶基因和酰基转移酶基因的筛选与鉴定具有参考作用和重要的意义。
[0020]本专利技术糖基转移酶LrGT71、LrGT16、酰基转移酶LrAT81、糖基转移酶LrGT22在同一体系中能够直接催化花青素合成花青素
‑3‑
酰基芸香糖基
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葡萄糖苷。
[0021]本专利技术的糖基转移酶LrGT71、LrGT16、酰基转移酶LrAT81、糖基转移酶LrGT22具有特定的催化顺序，其中LrGT71为第一步，LrGT16为第二步，LrAT81为第三步，LrGT22为最后一步。
附图说明
[0022]图1.目标蛋白纯化SDS
‑
PAGE检测，M：蛋白marker，1：LrGT71、2：LrGT16、3：LrAT81、4：LrGT22。
[0023]图2.重组LrGT71催化矮牵牛素反应HPLC(上)及质谱(下)检测。
[0024]图3.重组LrGT16催化矮牵牛素
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葡萄糖苷反应HPLC(上)及质谱(下)检测。
[0025]图4.重组LrAT81催化矮牵牛素
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芸香糖苷反应HPLC(上)及质谱(下)检测。
[0026]图5.重组LrGT22催化矮牵牛素
‑3‑
香豆酰芸香糖苷反应HPLC(上)及质谱(下)检测。
[0027]图6.重组LrGT71、LrGT16、LrAT81、LrGT22同一体系催化矮牵牛素反应HPLC检测。
具体实施方式
[0028]以下实施例是对本专利技术的举例说明，而不是对本专利技术的限制。
[0029]下列实施例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行。
[0030]实施例1：黑果枸杞花青苷糖基转移酶基因LrGT71、LrGT16、LrGT22和酰基转移酶基因LrAT81的筛选
[0031]通过黑果枸杞基因组及转录组测序信息和注释信息，筛选具有植物次生代谢产物糖基转移酶保守结构PSPG box的糖基转移酶序列及具有花青苷酰基转移酶保守序列的酰基转移酶序列，进一步以黑果枸杞果实发育与成熟过程中花青苷的含量与基因表达量具有正相关的关系，再结合系统发育树对候选基因的功能预测。最终筛选得到的糖基转移酶基因有LrGT71、LrGT16、LrGT22和酰基转移酶基因LrAT81，它们的预测功能分别为花青苷
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葡萄糖基转移酶、花青苷
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鼠李糖基转移酶、花青苷
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葡萄糖基转移酶和花青苷
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22或酰基转移酶LrAT81，其特征在于，糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示，酰基转移酶LrAT81的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.编码权利要求1所述的糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22、酰基转移酶LrAT81的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22、酰基转移酶LrAT81的编码基因分别为基因LrGT71、LrGT16、LrGT22和LrAT81，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。4.权利要求1所述的糖基转移酶LrGT71、LrGT16、LrGT22和/或酰基转移酶LrAT81在具有多个修饰基团的稳定花青苷生物合成中的应用。5.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，糖基转移酶LrGT71在催化花青素合...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨小满，王瑛，曾少华，李忠席，杨超，艾培炎，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：