一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA及其重组慢病毒载体和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA及其重组慢病毒载体和应用，属于基因沉默技术领域。本发明专利技术设计2种沉默HS3ST5基因表达的shRNA，并构建携带所述shRNA的重组慢病毒质粒，利用包装出重组慢病毒建立了敲降HS3ST5的重组BHK

【技术实现步骤摘要】
ID NO:1和/或SEQ ID NO:3所示。
[0008]本专利技术提供了一种含shRNA的重组慢病毒质粒，所述shRNA为所述shRNA。
[0009]优选的，所述重组慢病毒质粒的骨架质粒为pLKO.1载体。
[0010]本专利技术提供了一种重组慢病毒，由所述重组慢病毒质粒和辅助质粒拯救得到。
[0011]优选的，所述辅助质粒包括psPAX2辅助质粒和pMD2.G辅助质粒；
[0012]所述拯救的方法为在转染试剂的作用下将重组慢病毒质粒、psPAX2辅助质粒、pMD2.G辅助质粒进行共转染；
[0013]所述重组慢病毒质粒、psPAX2辅助质粒、pMD2.G辅助质粒的质量比为4:3:1。
[0014]本专利技术提供了所述shRNA、所述重组慢病毒质粒或所述重组慢病毒在降低细胞中HS3ST5基因表达中应用。
[0015]本专利技术提供了一种敲降细胞中HS3ST5基因的试剂在制备降低病毒增殖的细胞或制备抗病毒感染的药物中的应用。
[0016]优选的，所述试剂包括以下一种或几种：所述shRNA、所述重组慢病毒质粒或所述重组慢病毒；
[0017]所述病毒包括利用HS受体入侵细胞的病毒。
[0018]本专利技术提供了一种抗病毒感染的药物，以所述shRNA、所述重组慢病毒载体或所述重组慢病毒为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。
[0019]本专利技术提供了一种基于所述shRNA介导的稳定敲降HS3ST5基因的重组BHK
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21细胞系
。/>[0020]本专利技术提供了所述重组BHK
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21细胞系在抵抗病毒感染的材料中的应用。
[0021]本专利技术提供了一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3所示。本专利技术设计出的shRNA具有良好靶向沉默细胞HS3ST5基因表达的作用。实验表明，shRNA以重组慢病毒载体形式包装成重组慢病毒，感染细胞后，成功建立敲除HS3ST5基因的重组BHK
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21细胞系，与空白对照组和空载体组相比，重组BHK
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21细胞系中HS3ST5基因或蛋白的表达量显著降低，以本专利技术保护的shRNA敲除细胞，获得显著降低的重组BHK
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21细胞系(BHK
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shHS3ST5
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807
‑2‑
KD和/或BHK
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shHS3ST5
‑
954
‑
47
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KD)。可见，本专利技术提供的shRNA具有较强的沉默HS3ST5基因表达的功能。
[0022]本专利技术提供了一种敲降细胞中HS3ST5基因的试剂在制备降低病毒增殖的细胞中的应用。本专利技术将病毒然然敲降HS3ST5的细胞，通过检测细胞中病毒蚀斑数量评估子代病毒形成情况，结果表明与对照细胞相比，shRNA
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807敲降HS3ST5的BHK
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21重组细胞系中的蚀斑数目降低40％，shRNA
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954敲降HS3ST5的BHK
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21重组细胞系中的蚀斑数目降低38％。可见本专利技术首次证明敲降HS3ST5的BHK
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21重组细胞显著抑制病毒的感染，为抗病毒感染药物提供了有效靶点，同时为抗病毒感染提供新思路。
附图说明
[0023]图1为敲降HS3ST5的重组BHK
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21细胞系中HS3ST5基因表达水平，其中(a)为敲降HS3ST5的BHK
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21重组细胞系中HS3ST5蛋白表达水平；(b)敲降HS3ST5的BHK
‑
21重组细胞系中HS3ST5mRNA表达水平；其中*表示与NC组相比，处理组细胞中HS3ST5基因表达水平显著降低，P<0.05；
[0024]图2为敲降HS3ST5的单克隆重组BHK
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21细胞中HS3ST5基因表达水平，(a)敲降HS3ST5的单克隆重组BHK
‑
21细胞中HS3ST5蛋白表达水平；其中*或**表示与NC组相比，处理组细胞中HS3ST5基因表达水平显著降低，*P<0.05，**＜0.01；
[0025](b)敲降HS3ST5的单克隆重组BHK
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21细胞中HS3ST5mRNA表达水平；
[0026]图3为两种shRNA敲降HS3ST5对FMDV子代病毒生成的影响。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(CCGGGCTCGTGGAGAAGTTCTTAAACTCGAGTTTAAGAACTTCTCCACGAGCTTTTTGC)和/或SEQ ID NO:3(CCGGGGAGAAGTTCTTAAACCTTCCCTCGAGGGAAGGTTTAAGAACTTCTCCTTTTTG)所示。
[0028]在本专利技术中，所述shRNA以BHK
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21细胞中的HS3ST5基因为模板设计得到，具有较强靶向HS3ST5基因沉默的功能。
[0029]本专利技术提供了一种含shRNA的重组慢病毒质粒，所述shRNA为上述方案中所述shRNA。
[0030]本专利技术对重组慢病毒质粒的骨架质粒没有特殊限制，采用本领域所熟知的骨架质粒即可。在本专利技术实施例中，所述重组慢病毒质粒的骨架质粒为pLKO.1载体。
[0031]在本专利技术中，所述重组慢病毒质粒的构建方法，优选为将shRNA正反向干扰序列退火形成双链粘末端DNA；
[0032]将所述双链粘末端DNA和pLKO.1载体用AgeI和EcoRI酶切，电泳回收目标片段后，得到酶切后的DNA片段和线性化pLKO.1载体；
[0033]将所述酶切后的DNA片段和线性化pLKO.1载体进行连接，得到重组慢病毒质粒。
[0034]在本专利技术中，所述shRNA807正反向干扰序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述shRNA954正反向干扰序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。所述退火的条件优选为100℃环境中4min后自然降温。
[0035]本专利技术对所述酶切和连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切和连接方法即可。所述连接后，优选对连接进行鉴定。所述鉴定的方法优选包括酶切鉴定和酶切阳性质粒的测序。所述酶切鉴定优选采用AgeI和EcoRI酶切，得到目标大小的片段说明为酶切阳性质粒。所述测序优选采用测序引物进行测序，得到测序结果与目标序列一致，说明成功获得重组慢病毒质粒。所述shRNA807和shRNA
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954的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5。
[0036]本专利技术提供了一种重组慢病毒，由所述重组慢病毒质粒和辅助质粒拯救得到。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3所示。2.一种含shRNA的重组慢病毒质粒，其特征在于，所述shRNA为权利要求1所述shRNA。3.根据权利要求2所述重组慢病毒质粒，其特征在于，所述重组慢病毒质粒的骨架质粒为pLKO.1载体。4.一种重组慢病毒，其特征在于，由权利要求2或3所述重组慢病毒质粒和辅助质粒拯救得到。5.权利要求1所述shRNA、权利要求2或3所述重组慢病毒质粒或权利要求4所述重组慢病毒在降低细胞中HS3ST5基因表达中应用。6.一种敲降细胞中HS3ST5基因的试剂在制备降低病毒增殖的细胞或制备抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁红，白兴文，卢曾军，黄磊，宫晓华，刘在新，孙普，李平花，包慧芳，李冬，马雪青，陈应理，曹轶梅，付元芳，赵志荀，张婧，王健，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：