用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒用于同时检测TERT

【技术实现步骤摘要】
用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及数字PCR检测领域，特别涉及用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]目前鉴别甲状腺结节良恶性最常见的检查方式是甲状腺B超，但是受到B超医生经验、水平等主观因素影响较大，阳性率在30~80%不等。如果B超检查提示结节存在恶性的可能，就需要进行穿刺活检，根据是否观察到肿瘤细胞，判断结节的良恶性。
[0003]穿刺病理是诊断甲状腺结节良恶性的金标准，但是由于结节穿刺细胞数量有限，并且受到涂片的影响，穿刺病理的诊断对病理医生要求很高。即使是国际上最好的甲状腺病理诊断实验室，也有20~40%穿刺成功的结节不能判断良恶性。
[0004]随着分子生物学的发展，甲状腺癌的特异性分子标志物不断被发现，因此通过细胞病理联合分子诊断可以显著增加恶性结节的确诊率。
[0005]BRAF和TERT基因是甲状腺癌诊断和预后判定方面非常重要的两个基因，其中BRAF基因是一种致癌基因，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控细胞内多种生理功能，如细胞生长、分化和凋亡等。BRAF基因在亚洲人群甲状腺癌中突变率非常高，大概在80%左右。在诊断方面，对于穿刺的细胞意义不明确的III、IV类的患者中，BRAF基因检测可使我们对甲状腺癌术前诊断的准确率达到95%以上。因此，BRAF基因为甲状腺癌的诊断提供了一个非常好的分子学辅助诊断的指标。
[0006]TERT基因是一个判定预后和复发的指标。主要突变位点为TERT基因启动子的C228T和C250T突变。在甲状腺癌的诊断过程中，如果发现TERT基因发生突变，就预示着患者预后会比较差，尤其是一些低分化的甲状腺乳头状癌。如果同时存在TERT突变和BRAF突变，即双重突变的患者，说明该肿瘤可能侵袭性比较强，复发转移概率比没有基因突变的患者更高，所以在手术方案的选择上，就倾向于更大范围的手术方案，以保证手术彻底性，并且术后要密切随访观察，其预后会更差。TERT和BRAF基因检测为术前判定甲状腺癌患者的良恶性和预后提供了分子基础。在广泛的甲状腺肿瘤患者中都有非常普遍的检测意义，今后在各个地区和医院将会很广泛的开展这两个基因的检测。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒用于同时检测TERT
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C250T、TERT
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C228T和BRAF V600E突变，所述试剂盒中缓冲体系包括Tris
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HCl、甘油、dNTPs、KCl、MgCl2、Taq DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱和甲酰胺，所述甜菜碱终浓度为0.4~0.6M，所述甲酰胺终体积浓度为0.5%
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2%和所述Taq DNA聚合酶终浓度为3U以上。
[0008]在一种实施方式中，所述Taq DNA聚合酶终浓度为3~4U。
[0009]在一种实施方式中，所述Tris
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HCl终浓度为0.04
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0.05M。
[0010]在一种实施方式中，所述甘油终体积浓度为4
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8%。
[0011]在一种实施方式中，所述dNTPs中dATP:dUTP、dCTP:dUTP、dGTP:dUTP的物质量比例都为1:2到1:3之间。
[0012]在一种实施方式中，所述KCl终浓度为20
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50mM。
[0013]在一种实施方式中，所述UNG酶终浓度为0.2U以上。
[0014]在一种实施方式中，所述UNG酶终浓度为0.2
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0.4U以。
[0015]在一种实施方式中，所述引物浓度为不小于400nM，探针浓度为不小于200nM。
[0016]在一种实施方式中，所述MgCl2终浓度为2
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6mM。
[0017]TERT基因突变C228T和C250T存在于启动子区，该区域GC含量较高（80%以上）。使用常规PCR反应液进行扩增时，没有扩增或扩增效果较差。而BRAF基因突变所在区域GC含量为39%
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40%，GC含量较低，如果对这两个基因进行双重检测，需要对PCR扩增缓冲液进行优化，以满足两个基因同时进行扩增检测的需求，因此，本专利技术优化一种PCR扩增缓冲液，实现了在一管体系中同时检测TERT基因启动子突变和BRAF基因V600E突变的目的。
[0018]本专利技术中，对TERT和BRAF两个基因进行双重扩增建立和优化时，评价标准为两个基因同时扩增；两个基因的扩增拷贝数基本相当；且符合理论拷贝数（例如，10ng基因组DNA约3000拷贝），此时表明体系扩增效率较高，可达到较高的检测灵敏度。如果一个基因扩增的拷贝数高，另外一个基因扩增的拷贝数低，则在双重检测中，两个基因的灵敏度不同，较低拷贝数的基因的灵敏度也较低。
[0019]另外，由于使用微液滴数字PCR作为检测平台，评价时也需要考虑检测体系的液滴稳定性。在液滴生成时，表面活性剂在水相液滴表面聚集，通过分子组装降低水油界面的表面张力，形成具有最低界面能的球形液滴，维持油包水微液滴的稳定性。只有液滴生成稳定，且液滴检测稳定（液滴数满足一定标准），检测结果才准确可靠。使用新羿制造科技（北京）有限公司）的数字PCR平台及配套耗材（样本制备仪、芯片分析仪、配套的微液滴生成芯片和生成油、微液滴检测芯片和检测油）生成的微液滴体积约0.5nL，30μL反应体系产生的理论微液滴数约为6万，对微液滴进行检测分析时，检测的液滴数越多（但不应超过理论生成的液滴数），则检测的灵敏度和稳定性越高，特别是在低拷贝靶标（低于50拷贝）检测时，如果丢失含靶标液滴，则造成定量结果偏低，当靶标拷贝数较高（高于50拷贝）时，通过泊松分布公式对检测结果进行校正，对定量结果影响不大，但通常要求至少检测50%以上生成的液滴，检测结果才是稳定可靠的，即检测液滴数达到3万以上，检测结果才满足标准。
[0020]具体地，以常规缓冲液为基础，调节缓冲液中各组分的浓度，同时增加甜菜碱、甲酰胺及不同组合，综合考虑对两个基因同时扩增的扩增效率、信噪比及液滴稳定性。当使用常规缓冲液时，仅BRAF基因可以扩增，进一步地，在缓冲液中加入甜菜碱后，TERT基因和BRAF可同时扩增，但BRAF拷贝数显著高于TERT基因拷贝数2倍以上，调整甜菜碱终浓度从0.25M增加到0.5M，TERT基因扩增拷贝数增加，但仍低于BRAF基因拷贝数，继续增加甜菜碱浓度到0.75M，则生成的液滴数明显下降，提示较高浓度甜菜碱的加入会影响液滴稳定性；进一步优化甜菜碱浓度在0.4
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0.6M，TERT拷贝数与BRAF拷贝数基本相当，略低于BRAF，液滴数较稳定，基本在3万以上。
[0021]在本专利技术中，为了进一步提高BRAF拷贝数和TERT拷贝数，增加检测的灵敏度，向缓冲液中进一步补充其他PCR增强剂，当加入甲酰胺后，则TERT基因拷贝数进一步增加，与BRAF拷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒用于同时检测TERT
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C250T、TERT
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C228T和BRAF V600E突变，所述试剂盒包括试剂盒缓冲体系、引物和探针，所述试剂盒中缓冲体系包括Tris
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HCl、甘油、dNTPs、KCl、MgCl2、Taq DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱和甲酰胺，所述甜菜碱终浓度为0.4~0.6M，所述甲酰胺终体积浓度为0.5%
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2%和所述Taq DNA聚合酶终浓度为3U以上。2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶终浓度为3~4U。3.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述Tris
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HCl终浓度为0.04
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0.05M。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝令香，程寻，杨文军，
申请(专利权)人：北京新羿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：