结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种结合藻红胆素（ＰＥＢ）的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白ｂｅｔａ１５５裂合酶催化藻红胆素与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合ＰＥＢ的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明专利技术的方法应用生物过程生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种结合藻红胆素(PEB)'的藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
技术介绍
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收 光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含apha和beta亚基，每个亚基中 藻胆色素(phycobiin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸 残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆 色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约 580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的 可见光，发射约640nm的焚光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660~670nm的 荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结 合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为 藻蓝胆素(phycocyanobUin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。PEC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671 )。与前人的方法不同，我 们发现Z"aZwe"。 sp. PCC7120中基因编码betal55裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源 的betal55裂合酶。这类betal55裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与PEC的beta亚基及其同 源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻红蓝蛋白类荧光 蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与PEC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。 藻红胆素PEB可由HOl、 PebA、 PebB协同催化生成(Alvey，R.M.,Karty,J.A.etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)，2448-2463 (2003))。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋白、APC脱辅基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏 PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC;隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中的APC的基因。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻 胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723， 2002.04.17。 一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用 藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产新型的藻红蓝蛋白。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质具 有优良的荧光性质，这种结合PEB的新型藻红蓝蛋白，为开发新型炎光探针提供了更多的选 择。本方法为藻红蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域 奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种结合藻红胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，它 是应用betal55裂合酶催化PEB与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备新型藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质(天然状态下藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白是与PCB结合)。将含有betal55裂 合酶基因、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌， 得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产新型藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本专利技术的技术方案是这样的 一种， 包括下述歩骤(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到 betal55裂合酶表达质粒；(2) 用基因工程方法，将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达 载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因/w/和pe力5或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到力o/和peZ^表达质粒；(4) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四个表 达载体中，得到表达质粒；(5) 将betal55裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o7和pe6A表达质粒和pe^ 表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应 用此工程菌通过发酵工程生产结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质 提纯技术，提纯得到相应的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本专利技术的技术方案也可以是这样的 一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白 基因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到betal55裂合酶和脱辅基蛋白表达质粒；(2) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o/和pe/^或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到力W和/ eM表达质粒；(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pe/W或其同源基因克隆于第四个表 达载体中，得到/ e力/f表达质粒；(4) 将betal55裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o7和pe/^表达质粒和 表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应 用此工程菌通过发酵工程生产结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质 提纯技术，提纯得到相应的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。上述中，所述的宿主菌为大肠杆菌； 所述的betal55裂合酶基因是指与//朋6a6v a sp. PCC7120中s^^^P基因同源的基因；所述 的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与如a6ae朋sp. PCC7120或7a/w770s"s sp. PCC7603 中pe"基因同源的基因。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤：　（１）用基因工程方法，将ｂｅｔａ１５５裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到ｂｅｔａ１５５裂合酶表达质粒；　（２）用基因工程方法，将藻红蓝蛋白类 脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；　（３）用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因ｈｏｌ和ｐｅｂＢ或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到ｈｏｌ和ｐｅｂＢ表达质粒；　（４）用基因工程方法， 将藻红胆素生物合成酶基因ｐｅｂＡ或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到ｐｅｂＡ表达质粒；　（５）将ｂｅｔａ１５５裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、ｈｏｌ和ｐｅｂＢ表达质粒和ｐｅｂＡ表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入 宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产结合ＰＥＢ的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合ＰＥＢ的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：佟顺刚，夏坤，
申请(专利权)人：广州天宝颂原生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]