一种提高氯化血红素的过氧化物酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高氯化血红素的过氧化物酶活性的方法，属于生物材料领域。本发明专利技术通过使用DNA编码的DNA微球提高氯化血红素的过氧化物酶活性，高效便捷。并且本发明专利技术方法中使用的DNA微球对反应体系中的离子浓度无特殊要求，因此能够与多种反应体系兼容，使用范围广泛。广泛。广泛。

【技术实现步骤摘要】
一种提高氯化血红素的过氧化物酶活性的方法


[0001]本专利技术涉及生物材料领域，具体涉及一种提高氯化血红素的过氧化物酶活性的方法。

技术介绍

[0002]过氧化物酶是一种能够直接催化过氧化氢去氧化酚类或胺类化合物的生物酶，其在化工生产、生物医药、分析检测等领域有着广泛的应用。然而，由于天然的过氧化物酶蛋白质的化学本质特性，使得它们的酶催化活性特别容易受到周围环境（温度、pH、金属离子等）变化的影响而失活，同时其制备和纯化工艺流程相对复杂且成本高昂，这些因素不利于其大规模广泛使用。
[0003]有机小分子具有合成简单、化学性质稳定、合成成本低的优点，因而寻找具有类似过氧化物酶活性的有机小分子有着巨大的潜力来替换现有的天然过氧化物酶。氯化血红素（Hemin）就是一种具有过氧化物酶活性的有机小分子，其能够像天然的过氧化物酶一样，催化3,3',5,5'
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四甲基联苯胺（TMB）发生显色反应，该显色反应在分析检测领域有着广泛的应用。然而，单独的Hemin分子的过氧化物酶活性非常弱，因而很难满足实际科研、临床检测对灵敏度的要求。因而，如何开发新的方法提高Hemin的过氧化物酶活性，成为Hemin能否实际应用的关键，具有重要的生产实践意义。
[0004]现阶段很少有直接提高Hemin活性的方法被报道。目前使用的技术主要是利用体外筛选技术筛选得到能和Hemin结合的特殊DNA序列，这些特殊的DNA序列一般都能够发生自我折叠形成DNAG
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四聚体的结构，而Hemin分子能够嵌入到DNAG
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四聚体结构中。嵌入到DNAG
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四聚体结构中的Hemin其过氧化物酶会得到显著的提升。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种提高氯化血红素（Hemin）的过氧化物酶活性的方法，能够显著提升Hemin的过氧化物酶催化活性，对于基于Hemin过氧化物酶活性特性的生产、科研、临床等应用具有重要意义。
[0006]为达到上述专利技术目的，采用如下技术方案。
[0007]本专利技术公开了DNA编码的DNA微球在提高氯化血红素的过氧化物酶活性中的用途，DNA的序列如下所示：SEQ ID NO.1：ATCTATCCTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACCCGTAT；和SEQ ID NO.2：ATCCTCTAAAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTAAAACCACACG。
[0008]优选地，上述DNA为组成DNA微球的两条模板链。
[0009]优选地，上述DNA的5
’
端具有磷酸化修饰。
[0010]优选地，上述DNA微球粒径为1
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15μm。
[0011]更优选地，上述DNA微球粒径为1
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10μm。
[0012]与单独的Hemin催化的3,3',5,5'
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四甲基联苯胺（TMB）显色反应相比，在Hemin催化的TMB显色体系中加入该DNA编码的DNA微球后，整个体系的反应速率得到了明显的提升。并且该DNA微球对反应体系中的离子浓度无特殊要求，因此能够与多种反应体系兼容，使用范围广泛。
[0013]优选地，制备上述DNA编码的DNA微球的反应体系，包括如下至少一种成分：上述DNA；连接酶；外切酶；聚合酶；缓冲液；dNTP混合物；环化引物；扩增引物。
[0014]优选地，连接酶包括T4连接酶。
[0015]优选地，外切酶包括核酸外切酶I、核酸外切酶III。
[0016]优选地，聚合酶包括Φ
29
聚合酶。
[0017]优选地，缓冲液包括以下至少一种：T4连接酶buffer；Φ
29
聚合酶缓冲液。
[0018]优选地，环化引物包括序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示序列：SEQ ID NO.3：TTAGGATAGATATACGGGTTC；SEQ ID NO.4：TTTTAGAGGATCGTGTGGTTTT。
[0019]优选地，扩增引物包括序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示序列：SEQ ID NO.3：TTAGGATAGATATACGGGTTC；SEQ ID NO.4：TTTTAGAGGATCGTGTGGTTTT。
[0020]优选地，上述扩增引物含有磷酸化的位点。
[0021]更优选地，磷酸化位点如*表示：SEQ ID NO.3：TTAGGATAGATATACGGGT*T*C；SEQ ID NO.4：TTTTAGAGGATCGTGTGGTT*T*T。
[0022]优选地，DNA编码的DNA微球的制备方法，包括如下步骤：模板链环化物的制备；ssDNA聚合物的制备；DNA微球的自组装。
[0023]更优选地，模板链环化物的制备，包括如下步骤：将组成DNA微球的两条模板链分别与相应的环化引物混合；依次向体系中添加T4连接酶buffer，T4连接酶和DEPC水；混匀并在室温下震荡，然后灭活T4连接酶；之后向混合液中加入核酸外切酶孵育后灭活核酸外切酶；之后纯化即得浓缩的模板链环化物。
[0024]更进一步优选地，模板链环化物的制备，包括如下步骤：
将组成DNA微球的两条模板链的储备溶液分别与相应的环化引物等摩尔量混合，然后以15
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20℃/min升温至80
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90℃保持3
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5min，以5
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10℃/min降至室温；依次向体系中添加15
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30μL 10X T4连接酶buffer，1
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2μL T4连接酶和75
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80μL DEPC水，混匀并在室温下震荡4h，然后在70
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75℃保持15
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30min以灭活T4连接酶；冷却后向混合液中加入10
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20μL核酸外切酶I和2
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5μL核酸外切酶III，37℃震荡10
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14h；然后通过热反应混合物40
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60min使核酸外切酶失活；之后使用超滤管纯化，TE buffer洗涤，即得浓缩的模板链环化物。
[0025]更优选地，ssDNA聚合物的制备包括如下步骤：将上述模板链环化物分别与聚合酶缓冲液、扩增引物、聚合酶、焦磷酸酶和dNTP混合物和超纯水混合；之后将反应混合物在摇床上扩增；扩增完成后纯化即得浓缩的ssDNA聚合物。
[0026]更进一步优选地，ssDNA聚合物的制备包括如下步骤：将上述模板链环化物10
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15μL分别与10
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20μL Φ
29
聚合酶缓冲液、2
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5μL扩增引物、4
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6μL Φ
29
聚合酶、6
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10μL焦磷酸酶和10
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. DNA编码的DNA微球在提高氯化血红素的过氧化物酶活性中的用途，其特征在于，所述DNA微球的序列如下所示：SEQ ID NO.1：ATCTATCCTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACCCGTAT；和SEQ ID NO.2：ATCCTCTAAAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTAAAACCACACG。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA的5
’
端具有磷酸化修饰。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA微球粒径为1
‑
15μm。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA微球的反应体系，包括如下至少一种成分：如权利要求1中所述的DNA微球的序列；连接酶；外切酶；聚合酶；缓冲液；dNTP混合物；环化引物；扩增引物。5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述环化引物包括序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：何磊，李俊采，谭蔚泓，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：