一种基于CRISPR的检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR的检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法及试剂盒。所述引物对根据如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR的检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种基于CRISPR的检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae, KP）是社区和医院获得性感染常见的革兰阴性条件致病菌，可以引起免疫功能低下或免疫缺陷患者呼吸系统、消化系统、泌尿系统感染和血液系统的感染。2020年中国细菌耐药监测结果显示，临床主要分离菌株中KP是仅次于大肠埃希氏菌的第二大条件致病菌，且其分离率呈现逐年上升的趋势。
[0003]1986年中国台湾地区首次报道了一种特殊的社区获得性KP，其在没有肝胆疾病史的前提下，引起宿主原发性侵袭性肝脓肿并伴有远端转移灶。根据这种特殊的临床特征，人们将这种KP定义为高毒力肺炎克雷伯氏菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae, HvKP）。HvKP常表现为高黏液表型，携带有pLVPK（224,152 bp）或pK2044（219, 385bp）毒力质粒，是一种比经典型肺炎克雷伯氏菌（classical Klebsiella pneumoniae, CKP）毒性更强的进化致病型。与CKP不同，HvKP往往在年轻健康个体中检出，而且更易造成健康人群的严重感染，如化脓性肝脓肿、眼内炎、脑膜炎、坏死性筋膜炎、严重肺炎等，呈现为多个部位同时感染或者从原发灶转移至其他部位。过去30年以来，HvKP感染的发病率在亚太地区稳步上升，在某些国家HvKP已经成为化脓性肝脓肿最主要的致病菌，而且致死率高达3%
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42%。
[0004]目前通常使用一般实验室检查和病原学鉴定的方法对可疑HvKP感染进行实验室诊断。HvKP的常规检测方法主要有形态学、血清学、免疫学和普通PCR。但这些检测方法繁琐而且对设备要求高，不利于基层推广和检测。近年来，等温扩增技术如环介导等温扩增技术（loop
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mediated isothermal amplification, LAMP），重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）等因其不需要昂贵的设备、反应快速，灵敏度高等优点发展迅速，逐渐在临床上应用起来。RPA是一种恒温扩增技术。反应温度在37℃
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42C之间，不需要温度升降进行变性，RPA不需要依赖昂贵仪器，灵敏度、特异性都较好，RPA可以实现对病原菌便携式的快速检测。
[0005]CRISPR系统是细菌及古细菌利用Cas效应蛋白并在crRNA探针的引导下抵御外源核酸入侵的一种获得性免疫防御系统。其能够切割和消除病毒入侵和其他外源核酸的威胁。CRISPR
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Cas系统利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。S. pyogenes Cas9（SpCas9，一般简称Cas9），因为其具有简单的PAM序列和在细胞内较高的基因编辑效率，因而是应用最广泛的Cas蛋白。Cas12a（又称为Cpf1）是和Cas9不同的CRISPR系统。
[0006]Cas12a蛋白识别富含T的PAM位点，在靶序列的5'端形成5个核苷酸的粘性末端，同时其自身可加工形成成熟的crRNA。Cas12a具有即可切割双链DNA也可切割单链DNA的切割活性。它在切割序列特异性的目标双链DNA之后，它的单链DNA的酶活性被激活，变成一种单
链DNA切碎机，将切割它附近的任何单链DNA。它对单链DNA切割速度极快，达到大于1000个分子每秒，且可以持续数小时以上。因此，Cas12a识别一个特异性双链DNA序列，可以切割数以百万计的非特异性的单链DNA分子。利用此特性，可将发光分子通过单链DNA与一种阻止这种发光分子发光的抑制分子连接在一起（简称为报告序列）。当Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，它会切割将这种发光分子和这种抑制分子连接在一起的单链DNA，这就移除了发光抑制分子，让发光分子发光，从而检测到光信号。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是建立一种基于CRISPR的检测替加环素耐药HvKP的高毒力相关基因及替加环素耐药基因tet(A)的可视化快速核酸检测方法，该方法通过设计RPA特异性引物，利用RPA扩增技术对核酸进行放大，将产物在crRNA探针的引导下，利用Cas12a酶切单链DNA报告序列，通过荧光信号进行检测，不仅能快速检测得到结果，并且解决了当前检测方法不敏感、时间长、成本高等缺点。
[0008]本专利技术选择HvKP的iucA、iroB、peg
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344、rmpA及tet(A)为检测靶基因。基于上述5个基因参考序列，结合实验室已测序的HvKP的5个基因序列和国家生物技术信息中心NCBI基因库中检索到的靶标基因并进行比对，选择上述5个基因的保守区域设计RPA引物对和crRNA探针。
[0009]优选地，所述RPA引物对基于iucA特异性1725 bp序列，如SEQ ID NO: 1所示；基于iroB特异性1116 bp序列，如SEQ ID NO: 2所示；基于peg
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344特异性903 bp序列，如SEQ ID NO: 3所示；基于rmpA特异性633 bp序列，如SEQ ID NO: 4所示；基于tet(A)特异性1200 bp序列，如SEQ ID NO: 5所示。
[0010]优选地，所述RPA引物对的序列用于检测iucA的引物对为F1/R1，如SEQ ID NO: 11至12所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测iroB的引物对为F2/R2，如SEQ ID NO: 13至14所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测peg
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344的引物对为F3/R3，如SEQ ID NO: 15至16所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测rmpA的引物对为F4/R4，如SEQ ID NO: 17至18所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测tet(A)的引物对为F5/R5，如SEQ ID NO: 19至20所示，或与上述序列相似性大于75%的序列。
[0011]在上述5个基因的保守区域寻找PAM位点TTTN，CRISPR/Cas12a系统的靶向特异性由crRNA探针3'末端的20个核苷酸序列决定的，所需的靶序列必须紧接在5'
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TTTN的PAM位点之后，并从中确定crRNA序列。
[0012]优选地，所述用于检测iucA的crRNA探针的指导序列为GCCGUGACCG CCGCGCUGGG；用于检测iroB的crRNA探针的指导序列为GCGUUAACGG CCAUGAAGUG；用于检测peg
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344的crRNA探针的指导序列为AUAGCUGGGGUUAUUCUUUC；用于检测rmpA的crRNA探针的指导序列为UUCAGGGAAA UGGGGAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的试剂盒，其特征在于：包括引物对、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列、缓冲液、Cas12蛋白、基因组DNA提取试剂、紫光手电。2.如权利要求1所述的基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应体系为5
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20 M上、下游引物，1浓度的重组酶聚合酶，1浓度的dNTP，10
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100 nM的crRNA探针，1
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10 M的FAM
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TTATT
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Dabcyl报告序列，1浓度的缓冲液1，10
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100 nM的Cas12a，1浓度的缓冲液2，1浓度的基因组DNA提取试剂1，1浓度的基因组DNA提取试剂2。3.一种基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的引物对，其特征在于：所述引物对基于iucA特异性1725 bp序列，如SEQ ID NO: 1所示；基于iroB特异性1116 bp序列，如SEQ ID NO: 2所示；基于peg
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344特异性903 bp序列，如SEQ ID NO: 3所示；基于rmpA特异性633 bp序列，如SEQ ID NO: 4所示；基于tet(A)特异性1200 bp序列，如SEQ ID NO: 5所示。4.如权利要求3所述的基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的引物对，其特征在于：用于检测iucA的引物对为F1/R1，如SEQ ID NO: 11至12所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测iroB的引物对为F2/R2，如SEQ ID NO: 13至14所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测peg
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344的引物对为F3/R3，如SEQ ID NO: 15至16所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测rmpA的引物对为F4/R4，如SEQ ID NO: 17至18所示，或与上述序列相似性大于75%的序列；用于检测tet(A)的引物对为F5/R5，如SEQ ID NO: 19至20所示，或与上述序列相似性大于75%的序列。5.一种基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的crRNA探针，其特征在于：所述crRNA探针根据如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10所示的靶向位点设计得到。6.如权利要求5所述的一种基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的crRNA探针，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜向党，李成龙，姚红，许春燕，武一帅，陈莹杰，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：