一种腈水解酶在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用及突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种腈水解酶在选择性催化6

【技术实现步骤摘要】
一种腈水解酶在选择性催化6
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氯烟腈合成6
‑
氯烟酸中的应用及突变体
(一)

[0001]本专利技术涉及一种来源于伯克霍尔德氏杆菌(Paraburkholderia graminis)的腈水解酶在选择性催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸中的应用以及突变体和应用。
(二)
技术介绍

[0002]氯代烟酸衍生物是重要的医药和农药产物中间体，它独特的吡啶环结构使其成为目前咋环化合物中开发应用范围最广的品种之一。6
‑
氯烟酸是一种重要的化工中间体，也是他扎罗丁等药物的关键中间体，并可用于新性农药产品的合成领域，市场需求逐年增加。6
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氯烟酸的绿色、高效合成越来越受到关注，同时对其合成纯度要求也非常高。目前报道的6
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氯烟酸合成方法主要为化学法，以氯苯为溶剂，以2
‑
氯
‑5‑
甲基吡啶为起始原料，在醋酸钴的催化下，直接氧化制备6
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氯烟酸粗品，并通过进一步的重结晶工艺获得6
‑
氯烟酸成品。但是化学合成方法环境污染严重、过程冗长、收率低，越来越不符合先进工业的要求，并且在合成过程中伴随着2
‑
氯烟酸的产生，要获得高纯度目标产物，后处理工艺复杂。
[0003]腈水解酶作为生物催化领域的重要工业酶，具有反应条件温和，环境友好，催化效率高等优点，在羧酸化合物合成中展现出日益巨大的应用潜力和重要价值。以烟腈氯代衍生物为底物，腈水解酶可以一步催化水解生成相应的烟酸氯代衍生物。在此过程中，腈水解酶的活性、底物选择性等催化性能是影响目标产物高效、高纯度合成的关键，挖掘对6
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氯烟腈具有高活力和高选择性的腈水解酶对建立6
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氯烟酸工业化酶法合成路线具有重要意义。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种腈水解酶在选择性催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸中的应用及突变体和应用，本专利技术来源于伯克霍尔德氏杆菌(Paraburkholderia graminis)的腈水解酶PgNit，除了具有催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸的水解活力外，亦具有催化2
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氯烟腈合成2
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氯烟酰胺的腈水合活力。基于此，对该酶进行了改造，获得了突变体PgNit
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A55S，消除了对2
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氯烟腈的水合活力，解决了传统腈水解酶催化氯代底物和反应选择性差的问题。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种伯克霍尔德氏杆菌(P.graminis)来源的腈水解酶PgNit在选择性催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸中的应用，所述腈水解酶PgNit的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0007]优选，所述的应用为：以含SEQ ID NO.1所示腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6
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氯烟腈和2
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氯烟腈为底物，以pH 6.0
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9.0的缓冲液为反应介质，在25
‑
40℃条件下进行反应，获得含6
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氯烟酸和2
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氯烟酰胺的反应液。所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2
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20g/L，优选10g/L；所述6
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氯烟腈和2
‑
氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100
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500g/L，各自均优选为300g/L。
[0008]优选的，所述缓冲液优选50mM、pH 7.0的PB缓冲液。优选所述反应温度为30℃。
[0009]优选的，所述腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液按如下方法制备：1)平板培养：将含腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基，经37℃过夜活化，获得单菌落；所述LB固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH 7.0；
[0010]2)种子培养：将单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180rpm培养10
‑
12h，获得种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0；
[0011]3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的量接种至含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，180rpm条件下培养至OD
600
为0.6
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0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基
‑
β
‑
D
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硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于28℃，180rpm条件下诱导培养10
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12h，菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体；
[0012]4)湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于pH5.0～9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10
‑
50kHz频率下(优选20kHz)破碎5
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30min(优选破碎2min，间隔10s，破碎10min)，收集破碎混合液，即获得粗酶液；所述pH5.0～9.0的缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为10mL/g。
[0013]第二方面，为了进一步提升腈水解酶PgNit对6
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氯烟腈的水解活力，同时完全消除对2
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氯烟腈的水合活力，本专利技术筛选获得腈水解酶突变体PgNit
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A55S，所述腈水解酶突变体PgNit
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A55S是将SEQ ID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸获得的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0014]任何对SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或者替换一个或几个氨基酸且具有催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸活力的，仍属于本专利技术的保护范围。
[0015]本专利技术还提供了腈水解酶突变体PgNit
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A55S编码基因，重组载体以及重组基因工程菌。
[0016]本专利技术可通过本领域常规方法将本专利技术的腈水解酶PgNit及其突变体PgNit
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A55S的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本专利技术的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种源自伯克霍尔德氏杆菌(P.graminis)的腈水解酶PgNit在选择性催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸中的应用，其特征在于，所述腈水解酶PgNit氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6
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氯烟腈和2
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氯烟腈为底物，以pH 6.0
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9.0的缓冲液为反应介质，在25
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40℃条件下进行反应，获得含6
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氯烟酸和2
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氯烟酰胺的反应液。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2
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20g/L；所述6
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氯烟腈和2
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氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100
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500g/L。4.一种用于权利要求1所述选择性催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸的腈水解酶突变体PgNit
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A55S，其特征在于，所述腈水解酶突变体PgNit
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A55S是将SEQ ID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸获得的。5.一种含权利要求4所述腈水解酶突变体PgNit
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A55S的编码基因的重组基因工程菌。6.如权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是将目的基因插入质粒pET28b(+)上的NcoI和XhoI之间，转化于E.coli BL21(DE3)宿主细胞中获得的。7.一种权利要求4所述腈水解酶突变体PgNit
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A55S在选择性催化6
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氯烟腈合成6
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氯烟酸中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含腈水解酶突变体PgNit
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A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，汤晓玲，金金，李雨怡，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：