本发明专利技术涉及荧光偏振检测技术领域，具体涉及一种适用于荧光偏振技术中检测基因甲基化的方法。本发明专利技术为克服现有技术存在的操作步骤繁琐、成本高、和效率低的问题，现采用的技术方案是：一种适用于荧光偏振技术检测基因ＤＮＡ甲基化的方法，是对下述的试剂进行扩增：所采用的试剂由ＭｇＣｌ２，１０×反应缓冲液，ｄＮＴＰｓ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶，靶基因启动子区ＣｐＧ岛非甲基化区引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的３’端带荧光标记的ＤＮＡ探针组成；与现有技术相比，本发明专利技术的优点是：１、开辟了新平台；２、全面准确；３、本方法步骤简单，操作简单；４、结果分析简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光偏振检测
，具体涉及一种适用于荧光偏振技术中检测基因甲基化的方法。
技术介绍
DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，是在基因组内启动子区CpG岛胞嘧啶第五位碳原子上加一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程，不改变碱基序列，通过影响基因表达改变其功能。DNA甲基化水平变化是人类癌症的特征性改变，重要DNA甲基化的检测在肿瘤预警、诊断、预防及早期干预治疗、耐药性预测、科学用药方面具重要指导价值。 目前，国内外DNA甲基化检测技术主要有电泳技术、DHPLC技术、Methylight技术、微阵列技术、焦测序技术，大多数设计、操作复杂，多需要电泳和多步后处理，费时费力、成本高，仪器设备昂贵，而效率有待提高，难以大规模推广应用。
技术实现思路
本专利技术要提供一种适用于荧光偏振技术检测基因DNA甲基化的方法，以克服现有技术存在的操作步骤繁琐、成本高、和效率低的问题。 为克服现有技术存在的问题，本专利技术的技术方案是 —种适用于荧光偏振技术检测基因DNA甲基化的方法，是对下述的试剂进行扩增 所采用的试剂由MgC12，10X反应缓冲液，dNTPs， T叫DNA聚合酶，耙基因启动子区CpG岛非甲基化区引物，耙区域甲基化及非甲基化序列的3'端带荧光标记的DNA探针组成；所采用的PCR扩增试剂包括10倍的PCR缓冲液；浓度各为2. 0 2. 5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度为0. 05-0. 2 y mol/L的耙基因的启动子区CpG岛非甲基化区上游引物及3'端带荧光标记的探针、浓度为0. 5-2ymol/L的靶基因的下游引物以及l-5U/iil的TaqDNA聚合酶，其中上游引物与下游引物浓度之比为5 10 : 1;所述扩增反应条件是94-95。C变性4-10min后，95。C孵育5-40秒，55-65。C孵育10-60秒，72t:孵育10-40秒，35-45个循环，最后一个循环无72。C孵育。 与现有技术相比，本专利技术的优点是 1、首次将荧光偏振技术用于基因DNA甲基化检测，开辟了基因DNA甲基化检测的新技术平台。 2、首次通过应用单端标记的甲基化与非甲基化特异的探针与靶区域的杂交，导致荧光偏振值的增加，据此全面检测靶区域多个甲基化位点，检测结果更全面准确。 3、本方法步骤简单，操作简单；由于本专利技术应用非对称PCR、3'端荧光标记的探针及特定的扩增循环条件，实现了基因DNA甲基化检测在闭管中完成，因此不易污染，结果准确。4、结果分析简单结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广；可用于检测临床血液或组织标本； 具体实施例方式下面将结合实施例对本专利技术进行详细地描述。实施例1 :抑癌基因P16启动子甲基化荧光偏振检测中， 1、所用的试剂是由MgC12，10X反应缓冲液，Taq polymerase, dNTPs，抑癌基因P16启动子引物，耙区域甲基化及非甲基化序列的3'端带荧光标记的DNA探针组成。 2、将上述试剂进行扩增反应在25uL体系中进行，加入PCR缓冲液2. 5 y L， 1. 0UTaq polymerase ;浓度分别为2. 0mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP ;浓度各为0. 05uM的上游引物和3'端带荧光标记的探针混合物，浓度为0. 5uM的下游引物，及过硫酸盐试剂盒处理的模板DNA 5ul.扩增反应条件是94t:变性5min后，95。C孵育10秒，6(TC孵育10秒，72。C孵育10秒，45个循环，最后一个循环无72t:孵育。然后对扩增产物进行荧光偏振值的检测，根据荧光偏振值与对照组的差异变化判读血液或组织标本的甲基化检测结果。 实施例2 :在对抑癌基因P53启动子甲基化荧光偏振检测中 1、所用的试剂是由MgC12，10X反应缓冲液，Taq polymerase, dNTPs，P53启动子基因的上、下游引物，耙区域甲基化及非甲基化序列的3'端带荧光标记的DNA探针探针组成。 2、将上述试剂PCR方法进行扩增反应在25uL体系中进行，加入PCR缓冲液2. 5 ii L， 1. 0U Taq polymerase ;浓度分别为2. 5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP ;浓度各为0. 2uM的上游引物和3'端带荧光标记的探针混合物，浓度为1. 5uM的下游引物，及过硫酸盐试剂盒处理的模板DNA 2ul. 扩增反应条件是94t:变性5min后，95。C孵育5秒，6rC孵育15秒，72。C孵育20秒，45个循环，最后一个循环无72t:孵育。然后对扩增产物进行荧光偏振值的检测，根据荧光偏振值与对照组的差异变化判读血液或组织标本的甲基化检测结果。权利要求一种适用于荧光偏振技术检测基因DNA甲基化的方法，是对下述的试剂进行扩增所采用的试剂由MgCl2，10×反应缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，靶基因启动子区CpG岛非甲基化区引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的3’端带荧光标记的DNA探针组成；所采用的PCR扩增试剂包括10倍的PCR缓冲液；浓度各为2.0～2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度为0.05-0.2μmol/L的靶基因的启动子区CpG岛非甲基化区上游引物及3’端带荧光标记的探针、浓度为0.5-2μmol/L的靶基因的下游引物以及1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，其中上游引物与下游引物浓度之比为5～10∶1；所述扩增反应条件是94-95℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育10-60秒，72℃孵育10-40秒，35-45个循环，最后一个循环无72℃孵育。全文摘要本专利技术涉及荧光偏振检测
，具体涉及一种适用于荧光偏振技术中检测基因甲基化的方法。本专利技术为克服现有技术存在的操作步骤繁琐、成本高、和效率低的问题，现采用的技术方案是一种适用于荧光偏振技术检测基因DNA甲基化的方法，是对下述的试剂进行扩增所采用的试剂由MgCl2，10×反应缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，靶基因启动子区CpG岛非甲基化区引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的3’端带荧光标记的DNA探针组成；与现有技术相比，本专利技术的优点是1、开辟了新平台；2、全面准确；3、本方法步骤简单，操作简单；4、结果分析简单。文档编号C12Q1/68GK101736083SQ20091002404公开日2010年6月16日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日专利技术者刘文超, 张菊, 张贺龙, 颜真 申请人:中国人民解放军第四军医大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于荧光偏振技术检测基因ＤＮＡ甲基化的方法，是对下述的试剂进行扩增： 所采用的试剂由ＭｇＣｌ２，１０×反应缓冲液，ｄＮＴＰｓ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶，靶基因启动子区ＣｐＧ岛非甲基化区引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的３’端带荧光标记的ＤＮＡ探针组成； 所采用的ＰＣＲ扩增试剂包括１０倍的ＰＣＲ缓冲液；浓度各为２．０～２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ和ｄＴＴＰ，浓度为０．０５－０．２μｍｏｌ／Ｌ的靶基因的启动子区ＣｐＧ岛非甲基化区上游引物及３’端带荧光标记的探针、浓度为０．５－２μｍｏｌ／Ｌ的靶基因的下游引物以及１－５Ｕ／μｌ的ＴａｑＤＮＡ聚合酶，其中上游引物与下游引物浓度之比为５～１０∶１； 所述扩增反应条件是：９４－９５℃变性４－１０ｍｉｎ后，９５℃孵育５－４０秒，５５－６５℃孵育１０－６０秒，７２℃孵育１０－４０秒，３５－４５个循环，最后一个循环无７２℃孵育。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张菊，颜真，刘文超，张贺龙，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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