一种重组抗体纯化方法技术

本发明专利技术属于抗体纯化技术领域，尤其涉及一种重组抗体纯化方法。所述方法包括：S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析；S2、过滤；S3、进行离子交换层析，离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱；S4、进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液包括：0.2

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗体纯化方法


[0001]本专利技术涉及抗体纯化
，特别涉及一种重组抗体纯化方法。

技术介绍

[0002]随着生物医药行业的快速发展，蛋白质药物成为现代药物研发的重要方向之一，其中重组抗体类药物占据主要份额，需求日益庞大。抗体药物作为一种高剂量使用的生物制品，对其纯度以及杂质残留量有极高的要求，以保证其通过注射等给药方式直接进入体内的安全性和有效性，因此，需要严格的质量监管措施。如何快速获得抗体的纯化产品以及优化其生产工艺，成为药物研发公司关注的要点。
[0003]重组抗体药物在生产过程中，宿主核酸的残留引起可能带来的传染性或者致瘤的风险而被作为生物制品安全监管中的重要一项。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)及世界各国对宿主核酸的残留都有严格的规定。因此，解决宿主核酸的残留是生物制品生产过程中必须面对的问题。核酸酶是一种可以降解核酸的酶，可将宿主核酸消化成3
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8个碱基长度的5
’‑
单磷酸寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性。因此，在一些重组抗体药物的生产工艺中常使用核酸酶去除残留核酸，然而，在通过核酸酶处理生物制品的过程中，可能会引入微量核酸酶残留。由于核酸酶本身也属于外源性物质，这些微量残留会对后续生物制品的应用造成一定的影响，并可能会引起毒性或免疫反应。
[0004]目前多采用高温高压方式使酶失活，但灭活条件较为苛刻，且仅能使酶失活，不能有效控制和去除核酸酶。另有通过层析等方式如ProteinA层析柱来捕获抗体，并利用离子交换层析作为精纯步骤，但容易引入抗体大小变异体和电荷变异体，由于一些物理的和化学的因素，导致抗体聚集现象发生，聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效。除此之外，聚集体还会影响抗体药物的生物活性、稳定性以及保存期等，这些问题使得抗体药物聚集体的控制及其去除成为药物开发过程中的一大挑战。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种重组抗体纯化方法，以解决现有技术中重组抗体核酸残留以及抗体纯化过程中聚集体形成的技术问题。
[0006]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供了一种重组抗体纯化方法，包括以下步骤：
[0008]S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；
[0009]S2、过滤所述亲和层析洗脱液，收集滤液；
[0010]S3、对所述滤液进行离子交换层析，所述离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱，收集离子层析洗脱液；
[0011]S4、对所述离子层析洗脱液进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液包括：0.2
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2mg/mL Poloxamer188、10
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50mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。
[0012]进一步地，所述透析缓冲液包括：0.2mg/mL Poloxamer188、10mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。
[0013]进一步地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。
[0014]进一步地，步骤S1中，所述亲和层析的层析柱为protein A层析柱。
[0015]更进一步地，步骤S1中，所述亲和层析包括下述步骤：
[0016]S11、将细胞培养上清加载到平衡好的所述protein A层析柱上；
[0017]S12、用磷酸盐缓冲液淋洗所述protein A层析柱，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
[0018]S13、用由0.1M甘氨酸和150mM NaCl组成的亲和层析洗脱液淋洗所述protein A层析柱，所述亲和层析洗脱液的pH为2.2
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4.0。
[0019]进一步地，步骤S3中，所述阴离子层析柱为Diamond Q Mustang层析柱。
[0020]进一步地，步骤S3中，所述阳离子层析柱为SP Bestarose BB层析柱。
[0021]进一步地，步骤S3中，所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱串联设置。
[0022]更进一步地，步骤S3中，所述离子交换层析包括以下步骤：
[0023]S31、将所述滤液加载到串联好的所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱上，其中，所述滤液的pH为5.5，电导≤5 mS/cm，上样流速为1mL/min；
[0024]S32、用50mM醋酸钠溶液淋洗所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱，直至电导基线趋于平衡，所述醋酸钠溶液的pH为5.5；
[0025]S33、拆下所述阴离子层析柱，之后采用200mM NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2
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5CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，之后采用1M NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，将电泳检测纯度高于95％的200mM、1M NaCl溶液洗脱的所述洗脱峰合并作为所述离子层析洗脱液。
[0026]进一步地，所述细胞培养上清中的细胞活率为70
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90％。
[0027]本专利技术的优点及积极效果为：
[0028]本专利技术以生产重组抗体的细胞培养上清为样本，依次经过亲和层析捕获富集抗体、阴离子层析分离核酸及核酸酶等杂质、阳离子层析进一步除杂处理，收集得到纯度较高的离子层析洗脱液，最后通过透析除去离子层析洗脱液，采用含有Poloxamer188、PEG3350等的透析缓冲液来防止抗体聚集，有效减少纯化后的抗体聚集体的产生，纯化后的抗体纯度在95％以上，符合品控要求，使用安全性高。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为本专利技术实施例不同活率下细胞培养上清中DNA酶残留检测结果图；
[0031]图2为本专利技术实施例不同活率下细胞培养上清中RNA酶残留检测结果图；
[0032]图3为本专利技术实施例的重组抗体经protein A层析和离子交换层析纯化后的DNA酶残留检测结果图；
[0033]图4为本专利技术实施例的重组抗体经protein A层析和离子交换层析纯化后的RNA酶残留检测结果图；
[0034]图5为本专利技术实施例经组合1配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；
[0035]图6为本专利技术实施例经组合2配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；
[0036]图7为本专利技术实施例经组合3配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；
[0037]图8为本专利技术实施例经组合4配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；
[0038]图9为本专利技术实施例经组合5配方的透本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组抗体纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；S2、过滤所述亲和层析洗脱液，收集滤液；S3、对所述滤液进行离子交换层析，所述离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱，收集离子层析洗脱液；S4、对所述离子层析洗脱液进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液包括：0.2
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2mg/mL Poloxamer188、10
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50mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，所述透析缓冲液包括：0.2mg/mL Poloxamer188、10mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。4.根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析的层析柱为protein A层析柱。5.根据权利要求4所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析包括下述步骤：S11、将细胞培养上清加载到平衡好的所述protein A层析柱上；S12、用磷酸盐缓冲液淋洗所述protein A层析柱，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；S13、用由0.1M甘氨酸和150mM NaCl组成的亲和层析洗脱液淋洗所述protein A层析柱，所述亲和层析洗脱液的pH为2.2
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【专利技术属性】
技术研发人员：余乐，刘佩佩，李耀东，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：