靶向内皮细胞递送载体及其在促进创面愈合中的应用制造技术

一种靶向内皮细胞递送载体，按如下步骤制取：首先通过化学诱导脂肪干细胞凋亡获得ABs，然后依次经低渗、超声、促愈合活性分子混合和挤压等步骤，获得载有促创面愈合活性分子的功能化凋亡小体纳米囊泡，制得的所述ABs表面具有CX3CL1蛋白。经验证，制得的ABs纳米囊泡生物相容性良好，可以通过CX3CL1/CX3CR1诱导缺氧微环境中的内皮细胞实现对其的“找我

【技术实现步骤摘要】
靶向内皮细胞递送载体及其在促进创面愈合中的应用


[0001]本专利技术涉及一种由生物材料制造的医疗产品，尤其涉及一种去除未知胞内容物的细胞外囊泡，具有安全性，再以其为递送载体，利于促进创面修复。

技术介绍

[0002]新生血管形成是驱动缺血组织修复的关键过程，然而对于慢性(难愈合)创面而言，长期的缺氧微环境导致血管化不足进而使得伤口延迟愈合。内皮细胞作为组成新生血管的关键细胞，无疑在血管化过程中发挥着核心作用。
[0003]CN202211118736.X公开了一种负载氢化镁的微针及其在伤口愈合中的应用，其微针贴片包括支撑层和微针，微针的针体由生物可降解材料制成，针尖处含有MgH2。经体外和体内验证，负载MgH2的微针贴片均可促进伤口愈合过程，促进M2极化，增强细胞增殖和迁移，改善血管生成和减少ROS产生。
[0004]CN202211169998.9公开了一种含银微载体，包括抗坏血酸、Ag
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和包被剂，其结构呈“花朵样”，表面积106.5m3/g
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20m3/g，具有介孔特性，孔径范围为5nm～225nm。经验证，含银微载体对环境ROS响应而释放Ag
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，以此负载外泌体，能提高外泌体对氧化变性的抵抗，改善外泌体的稳定性，避免外泌体被快速破坏而失活。负载外泌体的微载体递送至创面，如：糖尿病创面后，能有效地消除细菌并促进受损氧化细胞的凋亡，从而改善再生微环境，并在靶位点递送和持续释放外泌体，调节成纤维细胞、内皮细胞的生物学功能，促进血管新生，加速创面愈合。
[0005]靶向内皮细胞的递送策略近年来得到广泛关注(Science，2018，359，1335～1336)，递送载体主要包括脂质体(Biomaterials，2020，232，119706)和细胞外囊泡(EVs)。脂质体靶向内皮细胞的递送策略较为常见，例如：Kowalski等(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2015，89，40～47)通过整合素受体
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配体介导脂质体将药物递送到炎症部位的微血管内皮细胞中来干预炎症。作为合成纳米颗粒，脂质体具有易于修饰和制备的优点，但是这也不可避免地导致固有毒性。与脂质体相比，EVs是天然的细胞产物，因此具有低免疫原性和低细胞毒性。另外，脂质膜成分使EVs成为与靶细胞融合的理想选择，可以在负载药物的同时避免降解。因此，与脂质体相比，EVs作为药物载体具有更强的应用价值。
[0006]目前，基于EVs的药物负载方法包括内源性和外源性载药。内源性载药即通过树状大分子/细胞膜穿透肽等将药物递送入细胞内，然后诱导细胞产生包裹药物的EVs。例如Zhuang等(Nanoscale,2020,12:173
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188)制备了细胞穿透肽和肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)锚定的、与具有膜靶向抗癌活性的超顺磁性氧化铁纳米颗粒偶联的外泌体用于抑制肿瘤生长。但是这种方式制备复杂、药物包封率低。外源性载药包括电穿孔(Neurological Research，2008，30，288～293)、渗透冲击(Adv Healthc Mater.2022,11(5):e2100047)、挤压(Int J Pharm.2020,5；573:118802；J Extracell Vesicles.2021,10(13):e12163)、冻融(Micromachines(Basel),2019,1,10(11):750；JNanobiotechnology.2021,30,19(1):
459)、表面活性剂(Am.J.Transl.Res,2020,12:6302
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6313)、超声(Cancer Res,2017,77:3
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13；Theranostics,2022,12:1247
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1266)等，但是也仍存在以下问题：(1)无法去除与治疗目的无关的残留成分，可能存在潜在威胁；(2)对细胞膜表面物理、化学处理可能会破坏其结构和功能；(3)可能会影响装载稳定性，例如电穿孔会导致核酸聚集体的产生(J.Tissue.Eng.Regen,2016,10:E167
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E176)。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一个目的在于提供一种制取细胞外囊泡的方法，以去除未知胞内容物，提高应用于人体内的安全性。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供一种靶向内皮细胞递送载体，以所制取的细胞外囊泡为递送载体，利于促进(如：慢性糖尿病)创面愈合。
[0009]本专利技术的再一个目的在于提供一种囊泡，能靶向于内皮细胞，用于促进(如：慢性糖尿病)创面愈合。
[0010]本专利技术的又一个目的在于提供一种靶向内皮细胞递送载体在制备促进(如：慢性糖尿病)创面愈合药物中的应用。
[0011]本专利技术的第五个目的在于提供一种靶向内皮细胞递送载体在制备促进(如：慢性糖尿病)创面愈合医疗器械中的应用。
[0012]凋亡小体(ABs)是EVs中的一大类，是由程序性细胞死亡后形成的凋亡突起分解而形成的(Nature Reviews Drug Discovery，2022，21，379～399)。与外泌体和微囊泡只能通过胞饮
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内吞发挥作用相比，ABs自身可以发出“找我”信号和“吃我”信号，吸引吞噬细胞进行吞噬。此外，ABs的高表面
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体积比能促进与靶细胞的表面特异性相互作用(Journal of Controlled Release，2022，351，394～406)。因此，通过ABs靶向内皮细胞递送特异性促血管化药物是一种突破性的递送策略。
[0013]通过缺氧诱导内皮细胞表面表达CX3CR1蛋白，从而实现与凋亡小体表面CX3CL1实现特异性受体
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配体介导。“吃我”信号通过内皮细胞膜和凋亡小体膜表面的磷脂酰丝氨酸受体
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配体介导。在双重信号作用下，实现特异性靶向内皮细胞递送药物。
[0014]一种制取细胞外囊泡的方法，首先通过化学诱导(如：星孢菌素)脂肪干细胞凋亡获得ABs(粒径为：直径为600nm～1000nm)，然后依次经低渗、超声、促创面愈合活性分子混合和挤压等步骤，获得载有促愈合活性分子的功能化凋亡小体纳米囊泡。
[0015]制得的ABs表面具有CX3CL1蛋白，能与内皮细胞上的CX3CR1识别和结合，实现内皮细胞靶向递送。以此为载体，再将具有促进创面愈合的活性分子载入ABs，即可实现将这些活性分子靶向递送入内皮细胞，以此利于(如：糖尿病)创面修复
[0016]促创面愈合活性分子如：GLP
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36)及其代谢产物、利拉鲁肽及其代谢产物、司美格鲁肽及其代谢产物和去铁胺(DFO)。GLP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制取细胞外囊泡的方法，其特征在于包括如下步骤：首先通过化学诱导脂肪干细胞凋亡获得ABs，然后依次经低渗、超声、促愈合活性分子混合和挤压等步骤，获得载有促创面愈合活性分子的功能化凋亡小体纳米囊泡；制得的所述ABs表面具有CX3CL1蛋白。2.根据权利要求1所述的制取细胞外囊泡的方法，其特征在于所述的促创面愈合活性分子为DFO。3.根据权利要求2所述的制取细胞外囊泡的方法，其特征在于载有所述DFO的功能化凋亡小体纳米囊泡，其粒径为300nm～500nm，表面电荷达到
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15mV。4.根据权利要求1所述的制取细胞外囊泡的方法，其特征在于将ABs在低渗溶解缓冲液中进行重悬浮，4℃
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0.5℃，1小时
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0.2小时，获得细胞膜多孔的ABs。5.根据权利要求1所述的制取...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓明，钱姝桐，毛佳怡，崔文国，赵秋羽，刘芷默，赵彬帆，卢博伦，张柳成，毛曦嫒，张余光，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：