一种籼稻愈伤组织诱导培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种籼稻愈伤组织诱导培养基及其制备方法和应用，所述培养基的原料包括MS、蔗糖、植物胶、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4

【技术实现步骤摘要】
一种籼稻愈伤组织诱导培养基及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及培养基及其应用，尤其涉及一种籼稻愈伤组织诱导培养基及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球半数以上人口以大米为主食。近年来，随着世界人口增加、耕地减少、生物与非生物因素胁迫日益严重，水稻生产面临巨大挑战。随着分子生物学研究的深入，转基因技术的日趋成熟，不管是RNAi，基因过表达，还是目前的研究热点CRISPR/Cas9基因编辑技术，这些技术的应用都离不开遗传转化体系的建立，遗传转化已成为水稻遗传改良的一种有效手段。农杆菌介导的水稻高效遗传转化技术已经非常成熟，并取得了很大的成功。而水稻胚性愈伤组织就是农杆菌介导外源基因进行遗传转化的良好受体，它的优劣直接影响着水稻外源基因的转化的效率。
[0003]粳稻和籼稻是栽培稻主要的两种亚种，粳稻的愈伤组织诱导比较容易，再生率高，基于粳稻建立的愈伤组织遗传转化体系已经非常成熟了，而栽培面积占全球水稻80％的籼稻不适用目前的组织培养技术，其愈伤的诱导率普遍低下，且后续组织培养过程中容易发生褐化，遗传转化效率非常低，严重阻碍了籼稻的遗传改良。籼稻成熟胚愈伤组织的诱导率和质量是决定遗传转化效率的关键，而有研究表明适当改变籼稻愈伤组织诱导培养基的成分、调节外源激素浓度可以有效提高愈伤组织诱导率和质量(王磊等，基于多因素的光催化降解动力学，2011，化学试剂)。水稻成熟胚不受季节限制，取材方便，操作简单，污染率低，是诱导愈伤组织的良好外植体材料。因此籼稻成熟胚愈伤组织诱导培养基的改良可以提高籼稻的遗传转化效率，加快籼稻基因工程和分子育种的发展，为水稻育种提供更好的技术支撑，因此应用上具有很大的意义。
[0004]目前籼稻成熟胚愈伤组织诱导培养基的诱导率和质量普遍比较低，遗传转化较困难，而且仅限于特定的籼稻品种。因此籼稻成熟胚愈伤组织诱导培养基的改良是有必要的且还有很大上升的空间。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了解决现有技术所存在的技术问题，本专利技术旨在提供一种诱导率高的籼稻愈伤组织诱导培养基，并且，本专利技术还提供了该籼稻愈伤组织诱导培养基的制备方法和应用。
[0006]技术方案：本专利技术所述的籼稻愈伤组织诱导培养基的原料包括MS、蔗糖、植物胶、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和2,4
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D。
[0007]进一步地，所述培养基的原料还包括6
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BA和ABA，所述6
‑
BA在培养基中的浓度为0.2
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0.4mg/ml，ABA在培养基中的浓度为1
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4mg/ml，优选的，所述6
‑
BA在培养基中的浓度为0.4mg/ml，ABA在培养基中的浓度为2mg/ml。
[0008]进一步地，所述培养基的pH值为5.9。
[0009]进一步地，所述水解酪蛋白在培养基中的浓度为0.3g/L，谷氨酰胺在培养基中的浓度为0.5g/L，脯氨酸在培养基中的浓度为0.5g/L。
[0010]进一步地，所述MS在培养基中的浓度为4.4g/L，蔗糖在培养基中的浓度为30g/L，植物胶在培养基中的浓度为3g/L，2,4
‑
D在培养基中的浓度为3
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5mg/L。
[0011]本专利技术所述的籼稻愈伤组织诱导培养基的制备方法步骤为：将原料混合后煮沸混匀溶解，调节培养基pH值，高温高压灭菌，即得。
[0012]进一步地，所述培养基pH值调节至5.9，灭菌时间为20
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40min。
[0013]本专利技术所述的籼稻愈伤组织诱导培养基在籼稻成熟胚诱导中的应用。
[0014]进一步地，所述应用的方法为：选取籼稻成熟胚种子，去壳消毒处理后取出用无菌水冲洗，干燥后接种于权利要求1所述的愈伤组织诱导培养基上，于暗环境中培养7
‑
10天，得到籼稻成熟胚愈伤组织。
[0015]进一步地，所述籼稻成熟胚愈伤组织移至增殖培养基中，继续暗培养。
[0016]进一步地，所述消毒处理的步骤为：先用70％乙醇表面消毒2
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4min，再用2％活性氯含量的NaClO溶液浸泡40
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60min。
[0017]进一步地，所述籼稻成熟胚种子为黄华占、9311或天丰B。
[0018]专利技术原理：在本专利技术中：MS是MS培养基，特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，硝酸盐含量高，养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用MS作为培养基的基本培养基，在本专利技术愈伤组织诱导培养基的配制中要求每配制一升培养基添加4.4克粉剂。
[0019]蔗糖：蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织组织的再分化，本专利技术使用工业生产的分析纯的蔗糖，每配制一升培养基添加30g。
[0020]植物胶：植物胶在培养基中主要的作用是固定支撑的作用；一般使用纯度较高，没有杂质的植物胶，每配制一升培养基添加3g蔗糖。
[0021]水解酪蛋白：水解酪蛋白是多种氨基酸的混合物，为植物生长提供基本营养，对胚状体、不定芽的化有良好的促进作用，本专利技术培养基的配制中要求每配制一升培养基添加0.3g。
[0022]谷氨酰胺：谷氨酰胺的作用非常重要，是细胞合成核酸和蛋白质所必需的。谷氨酰胺缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，在本专利技术中，每配制一升培养基添加0.5g谷氨酰胺。
[0023]脯氨酸：脯氨酸是一种有机酸，被归类为蛋白质氨基酸，可以补充养分，也可以提高植物组织抗性，增加愈伤组织成活率。在本专利技术培养基的配制中要求每配制一升培养基添加0.5g。
[0024]2，4
‑
D：2，4
‑
D是具有代表性的合成植物生长素(auxin)，是一种生长素类似物。它的启动能力强，特别在促进愈伤组织形成上活力最高，常用于诱导愈伤组织的初代培养。本专利技术中，先将2，4
‑
D配制成0.2mg/mL的母液，再添加配制成3
‑
5mg/L的培养基。
[0025]6‑
BA：6
‑
BA是6
‑
苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素，6
‑
BA可以诱导愈伤组织发生；本专利技术培养基中，先将6
‑
BA配制成1mg/mL的母液，再添加配制成0.2
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0.4mg/L的培养基。
[0026]ABA：是一种抑制生长的植物激素，诱导芽休眠，抑制种子萌发，调节种子胚的发育，提高植物抗逆性。本专利技术中，先将ABA配制成0.2mg/mL的母液，再添加配制成1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种籼稻愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述培养基的原料包括MS、蔗糖、植物胶、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和2,4
‑
D。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的原料还包括6
‑
BA和ABA，6
‑
BA在培养基中的浓度为0.2
‑
0.4mg/ml，ABA在培养基中的浓度为1
‑
4mg/ml。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述水解酪蛋白在培养基中的浓度为0.3g/L，谷氨酰胺在培养基中的浓度为0.5g/L，脯氨酸在培养基中的浓度为0.5g/L。4.一种权利要求1
‑
3所述的籼稻愈伤组织诱导培养基的制备方法，其特征在于，步骤为：将原料混合后煮沸混匀溶解，调节培养基pH值，高温高压灭菌，即得。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建祥，赵艳岭，杨宝林，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：