一种产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及菌株突变筛选方法技术

本发明专利技术提供一种产L

【技术实现步骤摘要】
一种产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌及菌株突变筛选方法


[0001]本专利技术涉及了生物工程菌株筛选领域，具体是一株产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌及菌株突变筛选方法。

技术介绍

[0002]L
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乳酸(L(+)
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Lactic acid)为乳酸的一种旋光异构体，是一种广泛应用于环保、食品、医药、制革、农业等诸多领域的化学原料，可用于合成生物可降解聚合物聚乳酸(PLA)产品，如包装、薄膜和塑料制品等。与传统塑料相比，生物塑料有可自然降解的优势，能减轻白色污染问题，减少人类对石油的依赖。
[0003]酶法、化学合成法、微生物发酵法可用于制备L
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乳酸，其中微生物发酵法具有成本低、工艺简便、环境友好、产品纯度高等优势。尤其是用农业废弃秸秆为底物，以凝结芽孢杆菌进行发酵，可在很大程度上降低以纯糖作为底物发酵的成本，同时也能变废为宝，减轻秸秆资源的浪费以及“秸秆燃烧”带来的环境污染。但目前以秸秆为底物进行微生物发酵法存在几个亟待解决的问题：(1)通过前期对秸秆的一系列预处理，原材料中含有大量的毒性物质，这些抑制物对细胞毒性大；(2)低温发酵需要严格控制杂菌污染，高温高压灭菌操作使发酵成本大幅提升；(3)发酵过程中乳酸的积累会导致pH不断降低，影响细胞代谢和生产，碱性中和剂如碳酸钙、氢氧化钙等的添加，不仅增加了下游分离纯化工艺的难度，提高生产成本，还会造成严重的环境污染；(4)传统凝结芽孢杆菌对木糖、纤维二糖、葡萄糖的利用率偏低，同时发酵时间较长；(5)生产的L
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乳酸光学纯度低，副产物多且糖酸转化率低。

技术实现思路

[0004]为解决目前凝结芽孢杆菌利用秸秆底物发酵产乳酸易染杂菌、产率低、纯度差、发酵周期长等问题，本专利技术提供了一株耐高温、耐秸秆底物毒性、及耐低pH的高产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌的复合诱变及筛选方法，能高效快速得到工业生产所需的。
[0005]本专利技术的第一个方面是提供一种可以高效发酵生产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌，所述的凝结芽孢杆菌于2022年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.26156.
[0006]本专利技术的第二个方面是提供一种产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌菌株突变筛选方法，所述的方法包括：
[0007]1)对冻存菌株复活培养后紫外诱变，随后在38
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42℃恒温培养进行高温驯化；
[0008]2)43
‑
47℃恒温培养进行高温驯化；
[0009]3)48
‑
52℃恒温培养进行高温驯化；
[0010]4)53
‑
57℃恒温培养进行高温驯化；
[0011]5)菌悬液转涂到含CaCO3的正常培养基中，放到培养箱恒温培养；
[0012]6)根据溶钙圈的形态、大小挑选80
‑
100个单菌落进行发酵实验，
[0013]7)遗传稳定性和发酵产物产量监测。
[0014]其中，步骤1)
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4)的高温驯化后，用无菌水刮取菌落形成菌悬液
[0015]优选的，所述的紫外诱变的条件为25
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35W，25
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30s。
[0016]更优选的，步骤1)
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4)的恒温培养方法是将上一步的菌液涂布在浓度范围在40
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100％酶解培养基中，涂布菌液的体积为100
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150μL；最优选的，梯度为20％。
[0017]最优选的，所述的方法步骤为：
[0018]1)将生长良好的凝结芽孢杆菌作为原始甘油管，涂布于40％的酶解平板后置于紫外灯下进行诱变处理，随后放置于40℃的避光培养箱中培养24
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48h进行高温诱变。
[0019]2)将耐40℃高温且在40％酶解平板上长势良好的平板菌种，用1mL无菌水刮取下来制成菌悬液一，吸取菌悬液一125uL均匀涂布于60％的酶解平板，在避光条件下放置于45℃的培养箱中继续高温诱变培养24
‑
48h。
[0020]3)将耐受45℃高温且在60％酶解平板上长势良好的平板菌种，按上一步骤所用方法涂布于80％的酶解平板，在避光条件下放置于50℃的培养箱中再次进行高温诱变培养24
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48h。
[0021]4)将耐受50℃高温且在80％酶解平板上长势良好的平板菌种按上一步骤所用方法涂布于100％的酶解平板，在避光条件下放置于55℃的培养箱中培养24
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48h。
[0022]5)将耐受100％酶解平板，且耐55℃的菌种，在同样的培养条件下不断转涂5代，取最终的菌悬液125uL，涂布于含有碳酸钙的正常固体培养基中，在55℃下培养24
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48h，观察溶钙圈的大小，用200uL枪头挑取溶钙圈较大的单菌落，于正常液体培养基中培养24
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48h，作为发酵培养的种子液。
[0023]6)将生长情况良好的种子液按照20％接种于50mL发酵培养基中，55℃下厌氧发酵48
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72h。利用高效液相色谱仪测定产乳酸情况，挑选发酵产乳酸高的菌株。
[0024]7)对挑选出的发酵产酸高的菌株再次进行遗传稳定性考察。通过在100％的酶解平板上不断转涂5
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10代，将转涂5
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10代后的菌株接入发酵罐中进行种子培养，在pH7.0，52
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55℃下培养24
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48h，待种子长好后按照10％的接种量转入发酵培养基中，在初始pH7.0，55℃下发酵48
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72h，发酵结束后利用高效液相色谱仪测定产乳酸量，挑选出发酵产酸量较高的菌株。
[0025]本专利技术的第三个方面提供本专利技术第一方面所述的菌株在发酵制备L
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乳酸中的应用。
[0026]本专利技术的第四个方面是提供本专利技术第一方面所述的菌株利用蒸汽爆破秸秆生成L
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乳酸的方法，所述的方法包括了菌株的预培养；接种发酵培养。在一个优选的实施方式中，所述的预培养是将甘油冻存的菌株接种于种子培养基中，在180
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200rpm，在50
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58℃温度下接种到200mL的预培养基中预培养12
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24h；所述的发酵培养是指将预培养的发酵液直接接种到含有蒸汽爆破秸秆的培养基中，维持温度在50
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58℃，不通气的情况下厌氧培养，48
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96h，期间流加补充发酵培养基。
[0027]另外，本专利技术也当然地提供前述凝结芽孢杆菌在秸秆发酵产乳酸工艺中的应用。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌于2022年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.26156。2.一种产L
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乳酸的凝结芽孢杆菌菌株突变筛选方法，所述的方法包括：1)对冻存菌株复活培养后紫外诱变，随后在38
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42℃恒温培养进行高温驯化；2)43
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47℃恒温培养进行高温驯化；3)48
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52℃恒温培养进行高温驯化；4)53
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57℃恒温培养进行高温驯化；5)菌悬液转涂到含CaCO3的正常培养基中，放到培养箱恒温培养；6)根据溶钙圈的形态、大小挑选80
‑
100个单菌落进行发酵实验；7)遗传稳定性和发酵产物产量监测；其中，步骤1)
‑
4)的高温驯化后，用无菌水刮取菌落形成菌悬液。3.根据权利要求2所述的方法，所述的紫外诱变的条件为25
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35W，25
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30s。4.根据权利要求2所述的方法，其中，恒温培养方法是将上一步的菌液涂布在浓度范围40
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100％酶解培养基中，涂布菌液的体积为100
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150μL；优选的，相邻两个步骤之间的酶解培养基浓度梯度为20％。5.根据权利要求4所述的方法，其中酶解培养基配制为：在培养基中加入相应体积分数的酶解液；其中酶解液中含30g/L葡萄糖为标准，按照相应比例添加需要补足的葡萄糖量、酵母粉3
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6g/L、氯化钠0.3
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0.7g/L、磷酸二氢钾1
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3g/L、硫酸铵1
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3g/L、七水合硫酸镁0.1
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0.3g/L、一水和硫酸锰0.1
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0.3g/L、七水合硫酸亚铁0.01
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0.03g/L，琼脂10
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20g/L，其余为纯化水，使用氢氧化钠调节pH为7.0。6.根据权利要求2
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5任一项所述的方法，其中具体操作为：1)将生长良好的凝结芽孢杆菌作为原始甘油管，涂布于40％的酶解平板后置于紫外灯下进行诱变处理，随后放置于40℃的避光培养箱中培养24
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48h进行高温诱变；2)将耐40℃高温且在40％酶解平板上长势良好的平板菌种，用无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：相金悦，康丽芳，袁涛，
申请(专利权)人：上海汉禾生物新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：