蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用。所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶第137位精氨酸经单点突变而得。本发明专利技术通过在来源于罗氏乳杆菌的野生型蔗糖磷酸化酶的第137位氨基酸残基位点引入点突变，显著提高了其在以蔗糖和甘油为原料生产2

【技术实现步骤摘要】
蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用
(一)

[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用。
(二)
技术介绍

[0002]蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase，SPase)是糖苷水解酶的GH13家族中的一类，EC号为2.4.1.7，属于转移酶类，其能够催化蔗糖磷酸解及其可逆反应，反应式为：SPase具有广泛的受体特异性，能够将葡萄糖基转移至不同受体，包括水、无机磷酸、含醇羟基、酚羟基或羧基等小分子化合物。SPase在小分子化合物的糖基化应用中表现突出，可高效合成多种重要的糖苷化合物。
[0003]甘油葡萄糖苷是一种由葡萄糖基和甘油通过糖苷键连接而成的糖苷化合物，包括2
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α
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葡萄糖基甘油(2
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O
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α
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D
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glucosylglycerol，2
‑
α
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GG，又简称2
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甘油糖苷，如式1所示)和1
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α
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葡萄糖基甘油(1
‑
O
‑
α
‑
D
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glucosylglycero，1
‑
α
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GG，又简称1
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甘油糖苷，如式2所示)。其中，2
‑
α
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GG是植物和微生物在胁迫条件下自发合成的一种天然渗透保护物质，其可以保护细胞免受高渗透压、高温、干旱以及紫外线等恶劣环境的破坏，也对人体皮肤有保湿、防紫外线伤害等效果，在护肤化妆品、细胞冻干、蛋白保护等方面具有良好的应用价值。
[0004][0005]通过蔗糖磷酸化酶催化甘油和蔗糖进行转糖基化反应，可以得到2
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α
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GG，但由于酶的糖基化位点的区域选择性问题，在生成2
‑
α
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GG的同时还有一定量的副产物1
‑
α
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GG的产生。前期我们筛选到了一个来源于罗氏乳杆菌的蔗糖磷酸化酶，具有十分高效的甘油糖基化活性，其催化甘油和蔗糖合成2
‑
α
‑
GG中具备良好的优点，包括反应速率快，热稳定性好等(International Journal of Biological Macromolecules 2022,209:376
‑
384)。但是其缺点是该酶的区域选择性不高，需要对其进行酶分子改造，提高甘油糖基化时的区域选择性，从而提高其应用性能。随着酶分子改造技术的不断进步，基于生物信息学的计算模拟和酶的半理性设计，结合定向进化和筛选的方法，可有效改造酶的催化性能，从而创新酶的应用技术。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种区域选择性好的蔗糖磷酸化酶突变体及其编码基因，以及其在酶催化制备2
‑
甘油糖苷中的应用。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种蔗糖磷酸化酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸
化酶第137位精氨酸经单点突变而得。
[0009]蔗糖磷酸化酶的活性位点残基，是在序列和结构上高度保守的两个天冬氨酸残基Asp和一个谷氨酸残基Glu组成的三联体。在蔗糖磷酸化酶转糖苷反应过程中，蔗糖的葡萄糖苷键首先被Glu质子化，同时Asp亲核攻击葡萄糖基上的异头碳原子，形成蔗糖
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酶共价中间体，然后释放D
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果糖；之后糖基受体底物亲核攻击葡糖基
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酶共价中间体，发生葡萄糖基的转移反应，而得到糖苷化合物。常见的糖基受体底物包括水、磷酸、寡糖及一些含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。通过改变活性口袋周围的残基，影响残基侧链效应，改变酶口袋的大小和动力学特性，从而提高酶对底物的催化活性和糖基化位点的区域选择性。
[0010]SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶(LreSP)来源于罗氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(GenBank：KRK51962.1)(International Journal of Biological Macromolecules 2022,209:376
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384)，可高效地对甘油实现糖基化，用于制备2
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甘油糖苷，其糖基化速率快，对产物的水解活性低。但是，该酶催化过程中会生成副产物1
‑
甘油糖苷。本专利技术针对野生型酶对甘油底物的催化活性和糖基化位点选择进行分子改造，从而得到催化活性提高且区域选择性显著提高的突变体。
[0011]首先通过PCR扩增得到该蔗糖磷酸化酶LreSP基因，将其克隆至大肠杆菌BL21(DE3)的表达载体pET28a，进行酶的过量表达。结合酶三维结构计算模拟，针对蔗糖磷酸化酶LreSP底物结构口袋中对底物区域选择性起到关键作用的氨基酸位点进行定点突变，再进行酶学比较分析后筛选得到酶突变体。
[0012]优选的，所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术还涉及编码所述对蔗糖磷酸化酶突变体的基因。
[0014]所述的蔗糖磷酸化酶突变体LreSP
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R137M的编码基因，可以根据其氨基酸序列进行密码子优化后合成的基因序列，亦可从Lactobacillus reuteri菌种基因组上PCR扩增后定点突变改造的基因序列。优选的，所述酶突变体LreSP
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R137M编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术还涉及含有所述编码基因的重组载体和基因工程菌。
[0016]本专利技术还涉及所述蔗糖磷酸化酶突变体在微生物催化制备2
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α
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葡萄糖基甘油中的应用。
[0017]具体的，所述应用为：构建含有所述蔗糖磷酸化酶突变体编码基因的基因工程菌，以基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞破碎液为催化剂，以甘油为底物、以蔗糖为糖基供体，进行催化反应，制得所述2
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α
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葡萄糖基甘油。
[0018]可将该蔗糖磷酸化酶突变体的基因克隆到表达质粒，并转化到宿主细胞中，经过诱导发酵制作成酶制剂后，用于催化甘油糖基化制备2
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甘油糖苷。所述的表达质粒和宿主细胞，优选pET28a质粒和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，即构建重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28a
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LreSP
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R137M)。
[0019]优选的，全细胞催化反应体系中，菌体的添加量为10～100g/L(优选100g/L)，甘油的浓度控制1～3mol/L(优选1.5mol/L)，蔗糖的浓度控本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶第137位精氨酸经单点突变而得。2.如权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.编码权利要求1所述蔗糖磷酸化酶突变体的基因。4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.含有权利要求3所述编码基因的重组载体。6.含有权利要求3所述编码基因的基因工程菌。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，刘凯强，朱林江，陆跃乐，周家伟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：