一种磷酸酶的突变体及其在果糖和阿洛酮糖制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种磷酸酶的突变体及在制备果糖和阿洛酮糖中的应用。本发明专利技术通过大量筛选获得单位点突变的突变体，进一步通过饱和突变获得组合突变，经实验表明，相比野生型而言，特异性和催化活性均明显提升；建立淀粉制备果糖和阿洛酮糖制备体系，最终果糖转化率均超过90%，最终产物体系中果糖含量占总糖比例超过90%，非常适合制备阿洛酮糖以及高果糖浆等产品。因此，本发明专利技术具有较高的应用价值。本发明专利技术具有较高的应用价值。本发明专利技术具有较高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸酶的突变体及其在果糖和阿洛酮糖制备中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及磷酸酶的突变体及其果糖生物制备方法。

技术介绍

[0002]果糖属于单糖，是目前已知的健康新型糖源，甜度为蔗糖的1.2～1.8倍，天然存在于水果、蜂蜜和谷物的浆汁中。果糖有水果香味，热值低，不易被口腔内链球菌转化为酸，从而抑制龋齿的产生；其甜度的最高峰值来得快，去得快，甜味不会影响其它香味，具有增强产品风味的作用。果糖有良好的溶解性，人体吸收速度快，可快速补充机体能量，是运动及体力消耗大人群的主要体能补充来源，国外利用这一特性开发出了各种营养型、能量型、清凉型的固体饮料。
[0003]果糖含有结晶果糖的特殊医学用途配方食品正逐渐被越来越多的消费者所接受。果糖注射液作为新一代不依赖胰岛素的高能量营养输液，在世界医药市场的表现十分活跃，被美、英、德、日等国家收录入药典，己成为仅次于葡萄糖的第二大注射液。甘油果糖输液、果糖氯化钠注射液以及果糖Vc片剂等都已经用于心血管病、糖尿病、脑颅病及肝等的治疗；果糖还可以加快乙醇的代谢作用，可用于治疗乙醇中毒。因此，果糖凭借其独特优势成为众多食品、保健品、医药等产品的重要原材料。
[0004]目前工业上大规模生产果糖主要采用采用淀粉水解制葡萄糖，后者经固定化葡萄糖异构酶转化为果糖及富含果糖的糖浆，再经分离、结晶技术得到结晶果糖。也有相关研究直接将蔗糖进行水解、分离、结晶获得果糖。采用上述方法获得果糖含量高的高果糖浆和结晶果糖，需要经过复杂的色谱分离过程。文献(A Biomimetic Biotechnological Process for Converting Starch to Fructose:Thermodynamic and Evolutionary Considerations in Applied Enzymology.J.Am.Chem.SOC.1992,114,6980
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6987)公开了淀粉制备果糖的路线和思路，该方法基于磷酸化和脱磷酸化反应，相比传统方法依赖葡萄糖制备果糖的方法，有可能具有较高的转化率。专利WO2018169957A1同样公布了淀粉制备果糖的方法，同时公布了路线中各个酶的来源和反应条件，但是该专利文献中公开了很多淀粉制备很多产物的方法，而且针对淀粉制备果糖实施方案，尽管标明了反应条件，但是并未给出真实转化率。淀粉制备果糖路线核心关键在于催化果糖6
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磷酸合成果糖的磷酸酶，该酶的高活性和催化特异性直接决定果糖得率，因此如何活性催化活性高、特异性好的催化果糖6
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磷酸脱磷酸反应合成果糖的磷酸酶是实现淀粉制备果糖的关键。
[0005]D
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阿洛酮糖是果糖的差向异构体，其甜度为蔗糖的70％，低热量，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；已经被美国食品及药品管理局(FDA)正式批准D
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阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中。传统阿洛酮糖制备方法依赖于生物转化果糖合成阿洛酮糖，而果糖生产成本远高于淀粉，因此如建立淀粉高效制备果糖路线，进而级联异构反应合成阿洛酮糖，将有助于实现阿洛酮糖的低成本制备。

技术实现思路

[0006]本专利技术的通过研究筛选获得磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点的突变：第122、126、149、178、181和175中的单个位置存在取代突变，或多个位置存在取代突变。
[0007]优选地，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点：第122位突变为Y、H或Q，或第126位突变为T、H、E或F，或第149位突变为M或E，或第178位突变为H或S，第181位突变为M、H、F或K，第175位突变为A或R。
[0008]更优选地，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点组合的突变：第122位和第126位同时存在突变，第122位和第149位同时存在突变，第122位和第178位同时存在突变，第122位和第181位同时存在突变，第122位和第175位同时存在突变；第126位和第149位同时存在突变，第126位和第178位同时存在突变，第126位和第181位同时存在突变，第126位和第175位同时存在突变；第149位和第1178位同时存在突变，第149位和第181位同时存在突变，第149位和第175位同时存在突变；第178位和第181位同时存在突变，第178位和第1175位同时存在突变；第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位和第149位同时存在突变，第126位、第149位和第178位同时存在突变；第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位和第178位同时存在突变；第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变。
[0009]本专利技术进一步提供所述磷酸酶的突变体在合成果糖中的应用。
[0010]具体地，以淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖为底物。
[0011]在一个具体实施方式中，当以淀粉底物,其反应体系为含有下述酶：
[0012](1)葡聚糖磷酸化酶GP，该酶催化麦芽糊精转化为葡萄糖1
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磷酸，(2)葡萄糖磷酸变位酶PGM,该酶催化1
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磷酸葡萄糖转化为6
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磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶：葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及如权利要求1
‑
4任一项所述的磷酸酶突变体；优选的，其反应体系中含有淀粉、Mg
2+
、葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及所述的磷酸酶突变体；更优选地，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的标号为TM1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶PGI选择来源于Thermus thermophilus,其在UniProt上的标号为A3DBX9。
[0013]优选地，反应体系中还含有葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶和聚磷酸激酶；优选地，葡萄糖异构酶来源于Thermus thermophilus，基因在Uniprot上的编号为P26997；葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的标号为Tfu_1811；聚磷酸激酶来源于Thermus thermophi lus，基因在KEGG上的编号为TT_C0637。
[0014]更优选地，所述反应体系中，淀粉的浓度为1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点的突变：第122、126、149、178、181和175中的单个位置存在取代突变，或多个位置存在取代突变。2.一种磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点：第122位突变为Y、H或Q，或第126位突变为T、H、E或F，或第149位突变为M或E，或第178位突变为H或S，第181位突变为M、H、F或K，第175位突变为A或R。3.如权利要求1或2所述的磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1仅存在下述氨基酸位点组合的突变：第122位和第126位同时存在突变，第122位和第149位同时存在突变，第122位和第178位同时存在突变，第122位和第181位同时存在突变，第122位和第175位同时存在突变；第126位和第149位同时存在突变，第126位和第178位同时存在突变，第126位和第181位同时存在突变，第126位和第175位同时存在突变；第149位和第1178位同时存在突变，第149位和第181位同时存在突变，第149位和第175位同时存在突变；第178位和第181位同时存在突变，第178位和第1175位同时存在突变；第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位和第149位同时存在突变，第126位、第149位和第178位同时存在突变；第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位和第178位同时存在突变；第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变。4.如权利要求1至3任一项所述磷酸酶的突变体在合成果糖中的应用，优选地以淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖为底物。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，当以淀粉底物,其反应体系为含有下述酶：（1）葡聚糖磷酸化酶，该酶催化麦芽糊精转化为葡萄糖1
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磷酸，（2）葡萄糖磷酸变位酶,该酶催化1
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磷酸葡萄糖转化为6
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磷酸葡萄糖；（3）葡萄糖磷酸异构酶：葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及如权利要求1
‑
3任一项所述的磷酸酶突变体；优选地，其反应体系中含有淀粉、Mg
2+
、葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及如权利要求1
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3任一项所述的磷酸酶突变体；更优选地，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotog...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建刚，田朝玉，陈朋，朱玥明，孙媛霞，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：