一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和应用技术

本发明专利技术提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白制备方法及产品和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)使含有釉原蛋白基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，获得以包涵体形式存在的重组釉原蛋白；(2)使用含浓度梯度尿素的溶解液依次梯度溶解步骤(1)中所述包涵体，离心，得上清液和沉淀；(3)混合步骤(2)中所述上清液与复性剂，过滤，滤液脱盐制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白。本发明专利技术创造性地应用含梯度浓度尿素的溶解液分离纯化釉原蛋白，加入不同浓度梯度的尿素梯度溶解包涵体，制得的目标蛋白纯度高、活性强。此外，该制备工艺操作简单，适宜工业放大。适宜工业放大。适宜工业放大。

【技术实现步骤摘要】
一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和应用。

技术介绍

[0002]蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。蛋白质功能的研究离不开蛋白的分离纯化。蛋白纯化主要是利用不同蛋白质间的相似性与差异，去除非蛋白物质，分离目的蛋白。当前蛋白纯化比较成熟的层析技术包括亲和纯化技术、离子交换色谱和凝胶过滤色谱等，在蛋白质的工业化生产中，这些技术虽然适用面广，但是常面临研发周期长、工序复杂、人力和物力成本高等缺陷，需要投入大量的金钱、人力和时间，使得成本大幅度上升。
[0003]釉基质蛋白是牙齿发育到钟状期，由内釉上皮细胞分化而来的成釉细胞合成和分泌一系列细胞外基质蛋白。自1975年首次提出来自赫特威氏上皮根鞘的釉质相关蛋白可以诱导牙根部无细胞性牙骨质形成以后，体外实验和临床治疗广泛证实釉基质蛋白能有效促进牙周韧带、牙骨质、牙槽骨再生，形成类似正常的牙周组织的排列，达到真正的牙周再生。釉原蛋白(amelogenin，Am)是发育中釉基质蛋白最主要的成分，也是釉基质蛋白中促进牙周再生的主要活性成分。但Am的组成不是单一的，至少有9种成分，分子量范围5～27kDa。和一般的重组蛋白相比，重组釉原蛋白有更稳定空间结构和物理性质。
[0004]CN101565463A公开了一种重组人釉原蛋白及其制备方法。该专利技术的技术方案如下：一种重组人釉原蛋白，通过下列方法制得：a.克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；b.构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1－hAm；c.将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1－hAm转化表达大肠杆菌菌株；d.诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST－hAm；e.通过GST亲和层析纯化融合蛋白。该专利技术首次从人乳牙胚组织中克隆得到人釉原蛋白成熟肽的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达的融合蛋白，人工合成的重组人釉原蛋白可以通过GST亲和层析纯化获得，但需要进一步通过酶切步骤和纯化步骤去除GST蛋白标签。
[0005]CN103014050A公开了一种重组猪釉原蛋白，由全长猪釉原蛋白基因编码，制备方法为：合成全长猪釉原蛋白基因；构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1
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pAm；将获得的重组原核表达质粒PGEX4T1
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pAm转化至大肠杆菌菌株；诱导获得的重组菌株表达融合蛋白GST
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pAm；切除获得的融合蛋白GST
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pAm的GST标签蛋白，获得重组猪釉原蛋白pAm。首次合成全长猪釉原蛋白的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白。该专利技术所得的克隆表达菌株可长期保存，并随时大量复制，能够较为方便快捷的大量人工合成重组猪釉原蛋白，也为将来釉原蛋白的批量化生产以及商品化提供了可能，但该方案与CN101565463A公开的釉原蛋白纯化方案比较类似，均需要通过酶切步骤和纯化步骤去除GST蛋白标签，暴露出釉原蛋白才能实现完整的生物学功能。
[0006]目前釉原蛋白的纯化面临研发周期长、工序复杂、人力和物力成本高等问题，因此
如何利用釉原蛋白的特性，研发简便，高效的釉原蛋白纯化方法是非常有意义的。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白制备方法及产品和应用。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0010](1)使含有釉原蛋白基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，获得以包涵体形式存在的重组釉原蛋白；
[0011](2)使用含浓度梯度尿素的溶解液依次梯度溶解步骤(1)中所述包涵体，离心，得上清液和沉淀；
[0012](3)混合步骤(2)中所述上清液与复性剂，过滤，滤液脱盐制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白。
[0013]本专利技术创造性地应用含梯度浓度尿素的溶解液分离纯化釉原蛋白，其中尿素为比较强的变性剂，可以通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，使包涵体变成可溶解的蛋白质，加入不同浓度梯度的尿素梯度溶解包涵体，制得的目标蛋白纯度高、活性强。此外，该制备工艺操作简单，适宜工业放大。
[0014]优选地，步骤(1)所述外源表达系统包括原核表达系统。
[0015]优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸杆菌。
[0016]优选地，所述釉原蛋白基因为人源、牛源、猪源或狗源种属的釉原蛋白基因。
[0017]优选地，步骤(2)所述溶解液的成分还包括Tris、TritonX
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100、β
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巯基乙醇或EDTA
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2Na中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括Tris和TritonX
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100的组合、TritonX
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100和β
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巯基乙醇的组合或β
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巯基乙醇和EDTA
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2Na的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
[0018]本专利技术步骤(2)所述溶解液的成分还包括Tris、TritonX
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100、β
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巯基乙醇或EDTA
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2Na中任意一种或至少两种的组合，其中Tris为碱性缓冲盐，可以帮助溶液pH维持在一定范围内，有助于蛋白质结构的稳定；TritonX
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100是一种温和的表面活性剂，可以溶解细胞膜上的蛋白质，可以洗去包涵体内细胞脂质和膜蛋白，起到去杂蛋白的作用；β
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巯基乙醇是一种强还原剂，可以打开包涵体中错配的二硫键，帮助包涵体复性过程中的正确结构的折叠，减少了复性过程中由于蛋白质错误折叠而引起的蛋白析出现象；EDTA
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2Na是一种金属螯合剂，可以鳌合溶液中的金属离子，有效防止金属引起的氧化作用，是一种抗氧化作用增效剂，同时也可以抑制蛋白酶的活力和微生物的生长，有效缓解蛋白质的降解。TritonX
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100配合具有浓度梯度的尿素可以有效溶解包涵体蛋白，洗去杂蛋白，制得的釉原蛋白纯度高。β
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巯基乙醇和EDTA
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2Na二者相辅相成，可协同增效，通过组分之间的在防止蛋白氧化方面的协同增效作用，纯化制得的釉原蛋白活性强，进一步地，更高活性的釉原蛋白具有更强的抗炎和修复作用。
[0019]优选地，步骤(2)所述包涵体与单次溶解使用的溶解液的质量体积比为1:(8
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15)g/mL。
[0020]所述(8
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15)中的具体数值可以选择8、9、10、11、12、13本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)使含有釉原蛋白基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，获得以包涵体形式存在的重组釉原蛋白；(2)使用含浓度梯度尿素的溶解液依次梯度溶解步骤(1)中所述包涵体，离心，得上清液和沉淀；(3)混合步骤(2)中所述上清液与复性剂，过滤，滤液脱盐制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述外源表达系统包括原核表达系统；优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸杆菌；优选地，所述釉原蛋白基因为人源、牛源、猪源或狗源种属的釉原蛋白基因。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述溶解液的成分还包括Tris、TritonX
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100、β
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巯基乙醇或EDTA
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2Na中的任意一种或至少两种的组合；优选地，步骤(2)所述包涵体与单次溶解使用的溶解液的质量体积比为1:(8
‑
15)g/mL；优选地，步骤(2)所述溶解液中尿素浓度的梯度范围为2
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6M；优选地，步骤(2)所述依次梯度溶解为尿素浓度由低至高梯度依次溶解；优选地，步骤(2)所述尿素的初始浓度为2M；优选地，步骤(2)所述溶解时伴随震荡操作；优选地，所述震荡的时间为1.5
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3h；优选地，步骤(2)所述溶解前还包括洗涤操作；优选地，所述洗涤使用的洗涤液成分包括Tris和/或TritonX
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100；优选地，所述洗涤液的p...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤杰，薛永永，蔡晓红，张启清，曾飒，
申请(专利权)人：广州栋方生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：