一种多黏菌素E甲磺酸钠的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种将多黏菌素Ｅ甲磺酸钠从含有小分子量杂质的混合物中分离纯化的方法，所述的方法为使用截流分子量在１０００～１００００之间的超滤膜进行分离纯化；本发明专利技术还涉及一种通过控制反应条件，并利用超滤膜分离技术制备高纯度多黏菌素Ｅ甲磺酸钠的方法，所述方法包括如下步骤：（ａ）将硫酸多粘菌素Ｅ加水溶解，向其中加入甲醛溶液，将二者进行反应；（ｂ）向步骤（ａ）的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应；（ｃ）取步骤（ｂ）中的反应溶液，采用超滤膜进行分离纯化。本发明专利技术提供的多粘菌素Ｅ甲磺酸钠的分离纯化方法具有低污染、低能耗，工艺简单、重现性好，且所得产品的纯度和活性很高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多黏菌素E甲磺酸钠的分离纯化方法，具体地涉及一种利 用膜分离技术从含有小分子量杂质的混合物中分离提纯多黏菌素E甲磺酸钠的 方法，此外还涉及一种通过控制反应条件，并利用膜分离技术制备高纯度多黏 菌素E甲磺酸钠的方法。
技术介绍
多黏菌素E (colistin)是一个由多种组分组成的多肽类抗生素，主要由El 和E2组成(或称为A或B)。在20世纪50年代，多黏菌素E就应用于临床，主 要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药绿脓杆菌引起的感染的治 疗。临床使用的多黏菌素E有两种， 一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也 称硫酸黏菌素)，另一种是供注射用的多黏菌素E甲磺酸钠(Colistimethate Sodium)。多黏菌素E甲磺酸钠之所以能作为注射剂使用，是因为它的毒性较硫 酸多黏菌素E显著降低，LD5。降低了 50倍以上。多黏菌素E甲磺酸钠是由1分 子的多黏菌素E和5分子的甲醛形成西佛氏碱后再同5分子亚硫酸氢钠通过共 价键结合而成。由于多黏菌素E是多组分药物，主要是由E,和E2组成，因此多 黏菌素E甲磺酸钠也是由多黏菌素E,甲磺酸钠和多黏菌素E2甲磺酸钠组成。多 黏菌素E,甲磺酸钠的分子量为1749.82;多黏菌素E2甲磺酸钠的分子量为 1735. 80。关于多黏菌素E甲磺酸钠的合成方法已属公知技术，就是由1分子的多黏 菌素E和5分子的甲醛形成西佛氏碱后再同5分子亚硫酸氢钠通过共价键结合 而成，具体合成反应为以硫酸多黏菌素E为原料，用水溶解后，先加甲醛溶 液，然后再加亚硫酸氢钠溶液进行反应，即可。可以看出，在多黏菌素E甲石黄酸钠的制备过程中可能引入的杂质有未反应完全的硫酸多黏菌素E原料，及 由该原料引入的硫酸根和过量的反应物甲醛和亚硫酸氢钠。因此，要想得到纯 度较高的目的产物，必须最大程度地去除这些杂质，这样才能得到高活性的多黏菌素E甲磺酸钠。关于多黏菌素E甲磺酸钠分离纯化工艺的研究报道比较少 见。Kotula等报道了采用阴离子交换层析法去除多黏菌素E甲磺酸钠中多余的 钠离子(参见Purification of polymyxin E methanesulfonate. Pol. PL78942 15 Dec 1971 2j仏 (PfilMiL (Eol^nd^丄itt^S^^用两种层析介质， 生产过程相对麻烦，而且需要使用大量的酸碱处理层析介质，不但增加了成本， 对环境也是一种负担。因此，有必要专利技术一种低污染、低能耗，工艺简单、重 现性好，且制得的产品的纯度和活性较好的多黏菌素E甲磺酸钠分离纯化方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种将多黏菌素E甲磺酸钠从含有小分子量杂质的混合物中分 离纯化的方法，所述的分离纯化方法包括通过超滤膜分离技术进行分离纯化， 使用的超滤膜的截流分子量一般在1000 10000之间，优选截流分子量在2000 6000之间的超滤膜。其中超滤膜可以是有机材料膜，如有机纤维素膜、聚砜膜等，也可以是各 种无机材料膜，如陶瓷膜、黏土膜和金属膜等，优选使用有机材料膜，更优选 有机纤维素膜或聚砜膜。其中所述的小分子量杂质，是指分子量小于600的分子、离子。可以是无 机小分子量杂质，如硫酸根离子、硫酸氢根离子、亚硫酸氢根离子、亚硫酸根 离子、钠离子；也可以是有机小分子量杂质，如甲醛等。本专利技术的超滤膜分离中所使用的溶剂可以是水或其他有机溶剂，优选水。本专利技术的分离纯化方法还包括在使用超滤膜分离之后，采用低温冷冻干燥法或者喷雾干燥法来干燥产品，以除去所使用的溶剂。本专利技术的多黏菌素E甲磺酸钠的分离纯化方法，具有低污染、低能耗，工 艺简单、重现性好的特点，用该方法得到的多黏菌素E甲磺酸钠的纯度和生物 活性较好，均优于现有的层析分离方法得到的产品。本专利技术的分离纯化方法可以用于从仅含有小分子量杂质的反应体系中分离 纯化多黏菌素E甲磺酸钠，也可以用于从受到小分子量杂质污染的多黏菌素E 甲磺酸钠中分离纯化多黏菌素F,甲磺酸钠。本专利技术还提供一种多黏菌素E甲磺酸钠的制备方法，其包括如下步骤(a) 将硫酸多粘菌素E加水溶解，向其中加入甲醛溶液，将二者进行反应；(b)向 步骤(a)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应；(c)取步骤(b)中的 反应溶液，采用超滤膜进行分离纯化。本专利技术的制备方法优选地还包括步骤(d):取步骤(C)中得到的产品，采用低温冷冻干燥法或喷雾干燥法来干燥产品。本专利技术所提供的多黏菌素E甲磺酸钠的制备方法，其中步骤(a)和步骤(b) 中的反应温度为1 50°C，优选温度为10 30°C;步骤(a)的反应时间为10 90分钟，优选为30 60分钟，步骤(b)的反应时间为2 24小时，优选为8 12小时；步骤(a)中使用的原料硫酸多黏菌素E与甲醛的摩尔比为1: 5.5 1: 25，优选为l: 10，原料硫酸多黏菌素E与步骤(b)中使用的亚硫酸氢钠的摩尔比为1: 6.5 1: 33，优选为1: 12左右；步骤(a)和步骤(b)中反应的pH值控制在4.0 10.0，优选pH值控制在6.0 9.0。步骤(c)中所述的超滤 膜的截流分子量一般在1000 10000之间，优选截流分子量在2000 6000之间 的超滤膜。所使用的超滤膜一般为有机材料膜，如有机纤维素膜、聚砜膜等， 也可用各种无机材料膜，如陶瓷膜、黏土膜和金属膜等，优选使用有机材料膜，更优选有机纤维素膜或聚砜膜。本专利技术提供的多黏菌素E甲磺酸钠的制备方法，通过在反应中使甲醛和亚 硫酸氢钠过量而使多黏菌素E完全反应，这样得到的产物多黏菌素E甲磺酸钠 中就只含有甲醛、硫酸根离子、亚硫酸氢钠等小分子杂质，然后再利用产物与 杂质之间分子量的较大差异，使用超滤膜进行分离纯化。其中使用的原料硫酸 多黏菌素E为含量较高的硫酸多黏菌素E，同时控制反应条件，使各步骤反应尽 量完全，分离纯化时所使用的超滤膜的截留分子量在1000 10000之间。本专利技术中所说的"含量较高的硫酸多黏菌素E原料"，是指多黏菌素E^口 E2 的含量不小于50%，测定方法可采用欧洲药典(5.0)或美国药典(29)所规定 的硫酸多黏菌素E高效液相色谱检查纯度的方法，优选产品质量符合欧洲药典 的质量要求的硫酸多黏菌素E原料。膜分离技术，是指利用特定孔径的膜来分离不同分子大小的物质，经常使 用的有纳滤膜(截留分子量在1000以下)和超滤膜(截留分子量在1000以上)。 通常情况下，选择滤膜时，膜的截流分子量应为目标分子的分子量的三分之一， 也即当截留目标分子的分子量为3000时，应选择截留分子量为1000的膜。就 分子量为1700多的多黏菌素E甲磺酸钠而言， 一般应该选择截留分子量为600 左右的纳滤膜来截留，众所周知，当选择该规格的纳滤膜时，二价离子如硫酸 根是很难滤过的，也即是说，硫酸根是很难去除的。我们在研究中惊奇地发现， 当使用截留分子量为3000左右的超滤膜分离反应液时，多黏菌素E甲磺酸钠能 被大部分截留，各种离子能很容易被去除，经水置换，干燥后(冷冻干燥或喷 雾干燥)，经检测产品活性的效价远高于美国药典规定的不少于390Pg/mg的标 准，通过本专利技术的方法制备的多黏菌素E甲磺酸钠的效价一般在450Pg/mg左右。 产品中甲醛残留量低于0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将多黏菌素Ｅ甲磺酸钠从含有小分子量杂质的混合物中分离纯化的方法，所述的分离纯化方法包括使用超滤膜分离技术进行分离纯化，其中所选用的超滤膜的截流分子量在１０００～１００００之间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯军，张喜全，朱裕辉，张来芳，赵伟，薛春佳，程艳菊，胡博新，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，江苏正大天晴药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]