用于纯化三聚体融合蛋白的方法和组合物技术

本公开提供了用于含有前胶原蛋白的C

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化三聚体融合蛋白的方法和组合物
[0001]与相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2021年4月13日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/087055和2020年8月31日提交的国际专利申请号PCT/CN2020/112439的优先权和利益，所述申请的公开内容为所有目的整体通过参考并入本文。
[0003]作为ASCII文本文件提交的序列表
[0004]下述ASCII文本文件上的提交内容整体通过参考并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：P10892
‑
PCT.210826.Sequence Listing_ST25.txt，记录日期：2021年8月25日，大小：160KB)。


[0005]本公开在某些方面涉及用于含有前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的蛋白质例如三聚体融合蛋白的亲和纯化的方法和组合物。本文还提供了含有Endo180的胞外域或其部分的多肽、融合蛋白和重组多肽，它们能够可逆结合前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列，例如与包含前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的三聚体融合蛋白形成复合物。

技术介绍

[0006]许多重大疾病靶点作为膜结合的三聚体存在和/或需要三聚化才变得有活性。含有前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的融合蛋白能够自发地自身三聚化，允许感兴趣的蛋白质结构域的三聚化，而不影响所述结构域的本源氨基酸序列或天然三维三聚体结构。含有前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的三聚体融合蛋白可以由细胞生产或分泌，导致需要纯化所分泌的三聚体融合蛋白。因此，需要允许可逆地选择所述三聚体融合蛋白的纯化方法将所述三聚体融合蛋白与样品例如细胞培养基中的其他蛋白质和碎片分离开。本文提供了满足这种和其他需求的方法、组合物、制品、试剂盒和装置。

技术实现思路

[0007]在某些情况下，本文公开了一种用于从样品纯化三聚体融合蛋白的方法，所述方法包括将包含三聚体融合蛋白的样品与连接到承载物的可溶性Endo180多肽接触。在某些实施方式中，所述三聚体融合蛋白包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列。在某些实施方式中，包含所述C
‑
端多肽序列的第一融合多肽能够与第二融合多肽的C
‑
端多肽序列形成多肽间连键(例如二硫键)。在某些实施方式中，各自包含前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的第一、第二和第三融合多肽能够在所述C
‑
端多肽序列处彼此形成多肽间连键(例如二硫键)，由此形成本文中公开的三聚体融合蛋白。在某些实施方式中，所述源自于前胶原蛋白(例如人类前胶原蛋白)的前结构域序列的C
‑
端多肽序列介导包含所述C
‑
端多肽序列的融合多肽的分子的三聚化。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三融合多肽在氨基酸序列上相同。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三融合多肽中的任两者或多者可以包含不同的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的融合多
肽能够通过所述C
‑
端多肽序列三聚化。在本文的任何实施方式中，所述三聚体融合蛋白可以包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，并且所述C
‑
端多肽序列能够自身三聚化并与Endo180胞外域多肽特异性结合。在本文的任何实施方式中，所述Endo180胞外域多肽可以吸附、结合、附着或以其他方式固定到承载物(例如层析中的固定相)，由此所述三聚体融合蛋白和Endo180胞外域多肽在所述承载物上形成复合物。在某些实施方式中，所述C
‑
端多肽序列能够自身三聚化并与所述可溶性Endo180多肽特异性结合，由此所述三聚体融合蛋白和可溶性Endo180多肽在所述承载物上形成复合物。在本文的任何实施方式中，所述Endo180胞外域多肽可能缺少Endo180 D1(CysR)序列。在本文的任何实施方式中，所述承载物可以包含装填在玻璃或金属管或构成开管毛细管的壁中的多孔固体(例如玻璃、二氧化硅或氧化铝)。
[0008]在某些实施方式中，所述Endo180胞外域多肽是与本文公开的融合多肽中的C
‑
端多肽序列特异性结合的可溶性Endo180多肽。在某些实施方式中，所述Endo180胞外域多肽与由融合多肽或蛋白的C
‑
端多肽序列形成的三聚体结构特异性结合。在某些实施方式中，所述三聚体融合蛋白和Endo180胞外域多肽在所述承载物上形成复合物。在某些实施方式中，所述方法包括从所述复合物除去未结合和/或非特异性结合的分子。在某些实施方式中，所述方法包括将所述复合物解离以释放出所述三聚体融合蛋白，由此从所述样品纯化所述三聚体融合蛋白。在某些实施方式中，本文公开了用于纯化稳定化三聚体形式的融合蛋白(其包含源自于前胶原蛋白(例如人类前胶原蛋白)的前结构域序列的三聚化结构域)或三聚体融合蛋白群体(其各自包含融合到所述源自于前胶原蛋白的前结构域序列的三聚化结构域的不同融合配偶体)的组合物和方法。
[0009]在某些实施方式中，本文提供了一种用于从样品纯化三聚体融合蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含三聚体融合蛋白的样品与连接到承载物的可溶性Endo180多肽接触，其中所述三聚体融合蛋白包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，其中所述C
‑
端多肽序列形成多肽间连键(例如二硫键)，并且其中所述可溶性Endo180多肽与所述C
‑
端多肽序列和/或其三聚体特异性结合，由此所述三聚体融合蛋白和可溶性Endo180多肽在所述承载物上形成复合物；(b)从所述复合物除去未结合和/或非特异性结合的分子；和(c)将所述复合物解离以释放出所述三聚体融合蛋白，由此从所述样品纯化所述三聚体融合蛋白。
[0010]在某些方面，本文公开了一种重组多肽，其包含Endo180胞外域序列，所述Endo180胞外域序列包含下述序列或由下述序列组成：Endo180结构域6(D6)的序列，Endo180结构域7(D7)的序列，Endo180结构域8(D8)的序列，Endo180结构域9(D9)的序列和/或Endo180结构域10(D10)的序列(例如D6、D7、D8、D9、D10、D1
‑
6、D2
‑
6、D3
‑
6、D4
‑
6、D5
‑
6、D1
‑
7、D2
‑
7、D3
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7、D4
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7、D5
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7、D6
‑
7、D1
‑
8、D2
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8、D3
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8、D4
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8、D5
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8、D6
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8、D7<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从样品纯化三聚体融合蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含三聚体融合蛋白的样品与连接到承载物的可溶性Endo180多肽接触，其中所述三聚体融合蛋白包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，其中所述C
‑
端多肽序列形成多肽间二硫键，并且其中所述可溶性Endo180多肽与所述C
‑
端多肽序列和/或其三聚体特异性结合，由此所述三聚体融合蛋白和可溶性Endo180多肽在所述承载物上形成复合物；(b)从所述复合物除去未结合和/或非特异性结合的分子；和(c)将所述复合物解离以释放出所述三聚体融合蛋白，由此从所述样品纯化所述三聚体融合蛋白。2.一种从样品纯化三聚体融合蛋白的方法，所述方法包括：将包含三聚体融合蛋白的样品与连接到承载物的可溶性Endo180多肽接触；其中所述三聚体融合蛋白包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，其中所述C
‑
端多肽序列形成多肽间二硫键，并且其中所述可溶性Endo180多肽与所述C
‑
端多肽序列和/或其三聚体特异性结合，由此所述三聚体融合蛋白和可溶性Endo180多肽在所述承载物上形成复合物；其中从所述复合物除去未结合和/或非特异性结合的分子，并且其中将所述复合物解离以释放出所述三聚体融合蛋白，由此从所述样品纯化所述三聚体融合蛋白。3.一种从样品纯化三聚体融合蛋白的方法，其中：将包含三聚体融合蛋白的样品与连接到承载物的可溶性Endo180多肽接触，其中所述三聚体融合蛋白包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，其中所述C
‑
端多肽序列形成多肽间二硫键，并且其中所述可溶性Endo180多肽与所述C
‑
端多肽序列和/或其三聚体特异性结合，由此所述三聚体融合蛋白和可溶性Endo180多肽在所述承载物上形成复合物；其中所述方法包括从所述复合物除去未结合和/或非特异性结合的分子；并且其中将所述复合物解离以释放出所述三聚体融合蛋白，由此从所述样品纯化所述三聚体融合蛋白。4.一种从样品纯化三聚体融合蛋白的方法，其中：将包含三聚体融合蛋白的样品与连接到承载物的可溶性Endo180多肽接触，其中所述三聚体融合蛋白包含融合到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，其中所述C
‑
端多肽序列形成多肽间二硫键，并且其中所述可溶性Endo180多肽与所述C
‑
端多肽序列和/或其三聚体特异性结合，由此所述三聚体融合蛋白和可溶性Endo180多肽在所述承载物上形成复合物，并且从所述复合物除去未结合和/或非特异性结合的分子；并且其中所述方法包括将所述复合物解离以释放出所述三聚体融合蛋白，由此从所述样品纯化所述三聚体融合蛋白。5.根据权利要求1
‑
4中的任一项所述的方法，其中三聚体融合蛋白重组产生。6.根据权利要求1
‑
5中的任一项所述的方法，其中所述三聚体融合蛋白由重组多核苷酸序列编码，所述重组多核苷酸序列包含与编码所述前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的多核苷
酸序列框内融合的编码所述异源多肽序列的多核苷酸序列。7.根据权利要求1
‑
6中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽序列源自于分泌蛋白或膜蛋白的胞外域。8.根据权利要求1
‑
7中的任一项所述的方法，其中所述三聚体融合蛋白从哺乳动物细胞表达。9.根据权利要求1
‑
8中的任一项所述的方法，其中所述样品是表达所述三聚体融合蛋白的细胞的培养基。10.根据权利要求1
‑
9中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是融合多肽。11.根据权利要求1
‑
10中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是Endo180
‑
Fc融合蛋白。12.根据权利要求1
‑
11中的任一项所述的方法，其中所述承载物包含树脂、粒子、珠子、固体基材、膜或其组合。13.根据权利要求1
‑
12中的任一项所述的方法，其中所述除去包括用缓冲液清洗所述复合物。14.根据权利要求1
‑
13中的任一项所述的方法，其中所述解离包括使用缓冲液从所述复合物洗脱所述三聚体融合蛋白。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述洗脱包括使用具有逐渐提高的盐浓度的多种缓冲液。16.根据权利要求1
‑
15中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽被固定在所述承载物上。17.根据权利要求1
‑
16中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽被共价连接到所述承载物。18.根据权利要求1
‑
16中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽被非共价连接到所述承载物。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Fc区，其中所述可溶性Endo180多肽通过蛋白A与所述Fc区的特异性结合被非共价连接到蛋白A树脂。20.根据权利要求1
‑
19中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的胞外域。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域1
‑
10(D1
‑
10)。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D1
‑
10
‑
Fc。23.根据权利要求20
‑
22中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列或其片段或变体。24.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域6
‑
10(D6
‑
10)或Endo180的结构域6
‑
9(D6
‑
9)。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D6
‑
10
‑
Fc或D6
‑9‑
Fc。26.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域
6
‑
8(D6
‑
8)。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D6
‑8‑
Fc。28.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域6
‑
7(D6
‑
7)。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D6
‑7‑
Fc。30.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域6(D6)。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D6
‑
Fc。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：46具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列或其片段或变体。33.根据权利要求20
‑
32中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含两个或更多个Endo180的结构域6(D6)。34.根据权利要求20
‑
33中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含两个或更多个连续的Endo180的结构域6(D6)。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是(D6)2‑
Fc。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是(D6)3‑
Fc。37.根据权利要求20
‑
36中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽不包含Endo180的结构域1
‑
5(D1
‑
5)中的任一者或多者。38.根据权利要求20
‑
37中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽不包含Endo180的结构域1
‑
4(D1
‑
4)中的任一者或多者。39.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域1
‑
6(D1
‑
6)。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D1
‑6‑
Fc。41.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域2
‑
6(D2
‑
6)。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D2
‑6‑
Fc。43.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域3
‑
6(D3
‑
6)。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D3
‑6‑
Fc。45.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域4
‑
6(D4
‑
6)。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D4
‑6‑
Fc。47.根据权利要求20所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽包含Endo180的结构域5
‑
6(D5
‑
6)。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是D5
‑6‑
Fc。49.根据权利要求1
‑
48中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是哺乳动物的。50.根据权利要求1
‑
49中的任一项所述的方法，其中所述可溶性Endo180多肽是人类
的。51.根据权利要求1
‑
50中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽序列是哺乳动物的。52.根据权利要求1
‑
51中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽序列包含TRAIL蛋白或其片段或变体。53.根据权利要求1
‑
52中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽序列包含4
‑1‑
BBL蛋白或其片段或变体。54.根据权利要求1
‑
53中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽序列包含OX40L蛋白或其片段或变体。55.根据权利要求1
‑
50中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽序列是病毒的。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述异源多肽序列来自于RNA病毒。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述RNA病毒选自HIV、RSV、冠状病毒、流感病毒和狂犬病病毒。58.根据权利要求55
‑
57中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含冠状病毒刺突(S)蛋白或其片段或变体。59.根据权利要求58所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS
‑
CoV
‑
2。60.根据权利要求58所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS
‑
CoV
‑
1。61.根据权利要求58所述的方法，其中所述冠状病毒是MERS病毒。62.根据权利要求55
‑
61中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含HIV gp120蛋白或其片段或变体。63.根据权利要求55
‑
62中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含RSV F蛋白或其片段或变体。64.根据权利要求55
‑
63中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含流感病毒HA蛋白或其片段或变体。65.根据权利要求55
‑
64中的任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含狂犬病病毒G蛋白或其片段或变体。66.根据权利要求1
‑
65中的任一项所述的方法，其中所述C
‑
端多肽序列包含前胶原蛋白的甘氨酸重复序列和C
‑
前结构域序列。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述甘氨酸重复序列包含甘氨酸
‑
X
‑
Y重复序列，其中X和Y独立地是任何氨基酸并任选为脯氨酸或羟脯氨酸。68.根据权利要求1
‑
67中的任一项所述的方法，其中所述C
‑
端多肽序列是人类的。69.根据权利要求1
‑
68中的任一项所述的方法，其中所述前胶原蛋白是proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)或其片段或变体。70.一种方法，其包括将靶分子与结合试剂接触，其中：所述靶分子包含连接到前胶原蛋白的C
‑
端多肽序列的异源多肽序列，所述结合试剂包含Endo180胞外域序列，所述Endo180胞外域序列包含下述序列或由下述序列组成：Endo180结构域6(D6)的序列，Endo180结构域7(D7)的序列，Endo180结构域8(D8)的序列，Endo180结构域9(D9)的序列和/或Endo180结构域10(D10)的序列(例如D6、D7、D8、D9、D10、D1
‑
6、D2
‑
6、D3
‑
6、D4
‑
6、D5
‑
6、D1
‑
7、D2
‑
7、D3
‑
7、D4
‑
7、D5
‑
7、D6
‑
7、D1
‑
8、D2
‑
8、
D3
‑
8、D4
‑
8、D5
‑
8、D6
‑
8、D7
‑
8、D1
‑
9、D2
‑
9、D3
‑
9、D4
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9、D5
‑
9、D6
‑
9、D7
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：梁朋，
申请(专利权)人：四川三叶草生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：