一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，对隐球菌基因组DNA中一个目的片段的6个区域设计了6条特异引物组，包括上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游环化引物LF和下游环化引物LB；利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增，保证LAMP扩增的高度灵敏度和快速性；该技术对隐球菌的检测灵敏度高、操作简便，成本低，通过核酸染料可以实时观察荧光曲线变化。观察荧光曲线变化。观察荧光曲线变化。

【技术实现步骤摘要】
一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒


[0001]本专利技术是关于生物检测的
，特别是关于一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。

技术介绍

[0002]新型隐球菌和格特隐球菌是中枢神经系统感染的重要原因，常引起艾滋病患者的机会性感染及一些天然免疫缺陷或医源性免疫抑制乃至免疫健全个人的感染，死亡率很高，在世界范围内仍是一个巨大的公共威胁。目前，隐球菌性脑膜炎(CM)的诊断通常是基于细菌培养，显微镜检及胶体金免疫层析法或乳胶凝集试验。但细菌培养周期长；显微镜检相对不灵敏，需要依靠有经验的工作人员；乳胶凝集试验及胶体金免疫层析法虽然灵敏快速，但由于勾状效应等原因也存在一定局限会影响诊断。
[0003]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，其能够解决细菌培养周期长和显微镜检不灵敏的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组，根据NCBI中隐球菌28s rRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段设计引物组，包括上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游环化引物LF和下游环化引物LB，具体序列如下：
[0006]上游外部引物F3：gcggaggacttgaaagttct(SEQ ID NO.1)；
[0007]下游外部引物B3：accaaagtcccccacgac(SEQ ID NO.2)；
[0008]上游内部引物FIP：aagcaccagctcccaagtcccacttaccaggccatcgc(SEQ ID NO.3)；
[0009]下游内部引物BIP：agcatatgtgtatgtcgcggggctggttgactctacttgccg(SEQ ID NO.4)；
[0010]上游环化引物LF：agtagcgtacactgccaactt(SEQ ID NO.5)；
[0011]下游环化引物LB：gacttggggtaagacgcctt(SEQ ID NO.6)。
[0012]本专利技术还提供一种隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括上述隐球菌的环介导等温扩增检测引物组。
[0013]进一步地，还包括环介导等温扩增反应试剂、指示剂、阳性对照质粒和阴性对照。
[0014]优选地，所述环介导等温扩增反应试剂包括：8U/μL Bst DNA聚合酶，1mM dNTP、20mM Tris
‑
HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％ Tween20、2mM MgSO4和0.8M Betaine。
[0015]进一步地，所述环介导等温扩增反应试剂还包括镁离子、甘油、二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和/或PEG8000。
[0016]优选地，所述指示剂为SYBR green I、羟基茶酚蓝指示剂或钙黄绿素/Mn
2+
染色剂。
[0017]优选地，所述试剂盒内隐球菌的环介导等温扩增反应体系为25μL，各组分的用量为：环介导等温扩增反应试剂13
‑
20μL、引物组1μL，指示剂1μL，加灭菌纯化水至25μL体系。
[0018]优选地，所述引物组内上游外部引物F3浓度为0.2μM、下游外部引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP浓度为1.6μM、下游内部引物BIP浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM、下游环化引物LB浓度为0.8μM。
[0019]优选地，所述阳性对照质粒为含隐球菌28s rRNA基因序列号28SEF211264.1中目的片段的质粒，通过提取到隐球菌目的片段和pUC57载体连接转化得到。
[0020]优选地，所述阴性对照为无菌无核酸酶去离子水。
[0021]与现有技术相比，根据本专利技术的一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，具有如下技术效果：
[0022](1)针对隐球菌基因的6个区域设计6条特异性引物，扩增产物具有高度特异性，试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优势；
[0023](2)反应时间仅需要45min，提高了检测效率，在恒温条件下反应，不需要价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，降低了检测成本，检测隐球菌方便快捷、成本低廉，适合基层医疗单位推广使用；
[0024](3)仅需要观察荧光曲线或者浑浊度判断反应结果，不需要打开反应管，避免污染的发生。
附图说明
[0025]图1是根据本实施例1的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测临床疑似隐球菌感染的荧光曲线示意图；
[0026]图2是根据本实施例2的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测临床分离出来的隐球菌的荧光曲线示意图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0028]除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0029]根据本专利技术优选实施方式的一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，根据NCBI中隐球菌28s rRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段(SEQ ID NO.7)，设计引物，隐球菌的环介导等温扩增检测引物组由上游外部引物F3(SEQ ID NO.1)、下游外部引物B3(SEQ ID NO.2)、上游内部引物FIP(SEQ ID NO.3)、下游内部引物BIP(SEQ ID NO.4)、上游环化引物LF(SEQ ID NO.5)和下游环化引物LB(SEQ ID NO.6)组成，针对隐球菌基因的6个区域设计6条特异性引物，扩增产物具有高度特异性，具体序列如下：
[0030]目的片段：
[0031]gcccttgttctatagatttgtctctaacatgttgggtctcggggggcttcctctagagacttggatgtaaggggctttacgcattcgcataacttatgaagtgtggatgactctaggaggggtctgagaatgtgctgtgccagc
caggctgataatagtttaattgttagcttggacttgtacacagtctcatcagtcttcagcttgggtcattgatattctgtaagtcaaaacttatccattcactgtagtaggttgcggaggacttgaaagttctctctgcaattgagacacttaccaggccatcgcaagttggcagtgtacgctactgattttatggtcgtgggggacttggg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，根据NCBI中隐球菌28s rRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段设计引物组，包括上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游环化引物LF和下游环化引物LB，具体序列如下：上游外部引物F3：gcggaggacttgaaagttct(SEQ ID NO.1)；下游外部引物B3：accaaagtcccccacgac(SEQ ID NO.2)；上游内部引物FIP：aagcaccagctcccaagtcccacttaccaggccatcgc(SEQ ID NO.3)；下游内部引物BIP：agcatatgtgtatgtcgcggggctggttgactctacttgccg(SEQ IDNO.4)；上游环化引物LF：agtagcgtacactgccaactt(SEQ ID NO.5)；下游环化引物LB：gacttggggtaagacgcctt(SEQ ID NO.6)。2.一种隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述隐球菌的环介导等温扩增检测引物组。3.如权利要求2所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括环介导等温扩增反应试剂、指示剂、阳性对照质粒和阴性对照。4.如权利要求3所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增反应试剂包括：8U/μL Bst DNA聚合酶，1mM dNTP、20mM Tris
‑
HCl、10mM(NH...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵望，张新联，
申请(专利权)人：苏州畅合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：