用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备川崎病转归试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，属于体外诊断和分子生物学交叉领域，和其他技术相比，本发明专利技术设计的这种系统/试剂盒可以从NLRC4基因各位点甲基化程度的指标上，评估丙种球蛋白(静丙)治疗效果，相比较一般采用的测量表，在定量上更具有说服力。更加有效、简便地对患者进行动态检测，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。活快速和经济节约的优点。活快速和经济节约的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备川崎病转归试剂盒中的应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断和分子生物学交叉领域，具体而言，涉及一种用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]川崎病(Kawasaki disease，KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征，1967年由日本学者Tomisaku Kawasaki(川崎富作)医生最初发现并报道，是以全身性小血管炎为主要病理变化的急性发热出疹性疾病。KD主要累及冠状动脉，导致动脉瘤和血栓形成，引起严重的并发症，其中最严重的是冠状动脉病变，心肌梗塞和冠状动脉瘤形成。目前KD已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要原因。典型KD的诊断标准认为具有以下6个临床标准中的5个即可诊断为KD：(1)持续5天以上的不明原因发热，抗生素治疗无效；(2)双眼球结膜充血，无脓性分泌物渗出；(3)口唇皲裂、潮红，口腔黏膜弥散性充血，杨梅舌；(4)急性期手足硬肿，掌跖红斑，恢复期指趾端有膜状脱屑或肛周脱屑；(5)多形性充血性红斑、皮疹；(6)非化脓性颈部淋巴结肿大，直径可达1.5cm甚至更大。也有研究者认为对于持续5天以上的不明原因发热、伴有其他3项主要临床表现，加上二维超声心动图或冠脉造影提示存在冠脉病变者也能确诊为KD。
[0003]深入研究川崎病的生物学特性，已成为国内外研究的重点和热点，而寻找新的药物靶标将有利于更好的优化治疗策略，降低并发症。研究显示DNA甲基化在炎症性疾病中发挥重要作用。因此致力于识别甲基化这一类生物靶标的研究有可能被用于预测川崎病治疗反应、观测治疗效果，预防以及改善相关并发症是川崎病研究的一大关键点。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的问题是开发一种用于检测川崎病的系统和/或试剂盒用于检测、预测川崎病，观察治疗效果，指导、评估川崎病临床用药。
[0005]为解决上述问题，本专利技术第一方面提供一种用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述系统和/或试剂盒用于焦磷酸测序，所述用于焦磷酸测序反应的测试样品为外周血。通常，所述试剂包括单一试剂、试剂群以及试剂系统，多种试剂特异性结合检测相关标志物，所述试剂中通常包括多种常用多肽或多核苷酸，尤其是包含一组用于生物标志物甲基化检测的引物。
[0006]进一步地，所述生物标志物为NLRC4基因。
[0007]进一步地，所述系统和/或试剂盒包括一对检测NLRC4基因启动子区域5个CG位点甲基化的特异性扩增引物以及特异性测序引物。
[0008]进一步地，所述5个CG位点如下所示：
[0009]CG(1)ATGACG(2)CACG(3)GGGACACCCTCCG(4)GAGTATAAACAG CCAGGGGCTTGCACAGGCACACTCACATTGGACG(5)。本研究开展了川崎病相关的候选基因甲基化修饰的研究。针对NLRC4(NLR Family CARD Domain Containing 4，NLR家族CARD域结合4基因)开展甲基化研究，NLRC4基因编码含有胱天蛋白酶募集域的NLR家族的成员，该基因编码炎症小体的关键成分间接感测来自病原细菌和真菌的特定蛋白质，并通过组装的炎症小体复合物来发挥免疫反应(促进caspase
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1活化，细胞因子生成和巨噬细胞焦化)，在对多种病原生物，组织损伤和其他细胞应激的先天免疫反应中起着至关重要的作用。有文献报道NLRC4基因甲基化参与调节甲基化药物羟乙酸的抗炎功能。
[0010]优选地，一对检测NLRC4基因启动子区域5个CG位点甲基化的特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物，其中所述甲基化特异性上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述甲基化特异性下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
[0011]优选地，所述系统和/或试剂盒包括一条甲基化特异性测序引物，所述甲基化特异性测序引物的序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]进一步地，所述系统和/或试剂盒在进行PCR检测时，所述PCR扩增的扩增程序为：首先95℃，10min的变性；接着95℃，30s；60℃，30s；72℃，1min，共40个循环反应；最后延伸反应72℃，5min。
[0013]第二方面，本专利技术提供评价川崎病的临床静丙治疗效果的方法，其特征在于，使用任一所述的系统和/或试剂盒中对患者进行检测，在外周血检测中，通过所述系统和/或试剂盒检测得到的NLRC4基因CG1至CG5位点以及CG1
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CG5总体甲基化水平在药物治疗后发生显著性改变，甲基化值均显著升高，证明静丙治疗有效。
[0014]第三方面，本专利技术提供一种前述系统和/或试剂盒的使用方法，其特征在于，使用前述的系统和/或试剂盒检测得到的川崎病患者中NLRC4基因CG1至CG5位点以及CG1
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CG5总体甲基化率，分析NLRC4基因CG1至CG5位点以及CG1
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CG5总体甲基化率与患者年龄、体重、中心粒细胞百分比、平均血红蛋白量、平均红细胞体积、纤维蛋白原、肌酐、血清淀粉样蛋白A、血沉、凝血酶原时间、中心粒细胞绝对值、C反应蛋白、球蛋白、DD二聚体、淋巴细胞百分比、淋巴细胞绝对值、单核细胞百分比、白球比值、红细胞体积分布宽度、红细胞计数、钙、嗜酸性粒细胞绝对值、嗜酸性粒细胞指标的相关性。
[0015]第四方面，本专利技术提供一种评估川崎病病情转归的方法，其特征在于，NLRC4基因CG1
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CG5总体平均甲基化率与淋巴细胞百分比，淋巴细胞绝对值，单核细胞百分比，白球比值，红细胞体积分布宽度，红细胞计数，钙，嗜酸性粒细胞绝对值，嗜酸性粒细胞等9项指标呈正相关，相关指标数值越高，相应的NLRC4基因CG1
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CG5总体平均甲基化越高。NLRC4基因CG1
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CG5总体平均甲基化率与年龄，体重，中心粒细胞百分比，平均血红蛋白量，平均红细胞体积，纤维蛋白原，肌酐，血清淀粉样蛋白A，血沉，凝血酶原时间(PT)，中心粒细胞绝对值，C反应蛋白，球蛋白，DD二聚体等15项指标呈反相关，相关指标数值越高，NLRC4基因CG1
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CG5总体平均甲基化越低。
[0016]本专利技术具备的有益效果：本专利技术首次提出NLRC4基因5个特定位点的甲基化可作为川崎病的检测位点。本专利技术提供的系统/试剂盒相较于传统试剂盒和临床主观判断，可以给予生物标志物定性定量检测，达到辅助科学性诊断的效果；使用本专利技术提供的系统/试剂盒检测时，可大大提升检测的灵敏度有利于提升基层医疗单位的医疗量能；通过使用本专利技术
提供的系统/试剂盒，可以监测临床用药疗效，提供指导意见，达到精准治疗的目的。
附图说明
[0017]图1为本专利技术具体实施方式中NLRC4基因5个CG位点信息及甲基化相关性R值；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述系统和/或试剂盒用于焦磷酸测序，所述焦磷酸测序反应的测试样品为外周血。2.如权利要求1所述的用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述系统和/或试剂盒包括一对扩增所述生物标志物启动子区域包含5个CG位点的片段的特异性引物。3.如权利要求2所述的用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述5个CG位点如下所示：CG(1)ATGACG(2)CACG(3)GGGACACCCTCCG(4)GAGTATAAACAG CCAGGGGCTTGCACAGGCACACTCACATTGGACG(5)。4.如权利要求2所述的用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述一对扩增所述生物标志物启动子区域包含5个CG位点的片段的特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物，其中所述甲基化特异性上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述甲基化特异性下游引物序列如SEQ ID No.2所示。5.如权利要求1所述的用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为NLRC4基因。6.如权利要求1所述的用于检测川崎病生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、评估川崎病相关病症的转归的系统和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述系统和/或试剂盒包括一条甲基化特异性测序引物，所述甲基化特异性测序引物的序列如SEQ ID No.3所示。7.一种评价川崎病的临床静丙治疗效果的方法，其特征在于，使用权利要求1～6任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞蓓蓉，郑邦旭，沈裕，吴军华，朱丰盛，邱海燕，沈懿菁，鲁炜慧，黄锂新，
申请(专利权)人：宁波市妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：