手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用。本发明专利技术的手足口病相关病毒平行检测液相芯片，主要由微球，特异性探针，生物素化的通用引物，链霉亲和素－藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是２６、３６和４６号微球；所述特异性探针是针对ＥＶ７１、ＣｏｘＡ１６和Ｅｃｈｏ９病毒ＶＰ１区域的氨基化的特异性探针，通用引物是经活化的生物素标记的肠道病毒通用引物。本发明专利技术不同的探针可以和不同的目的分子进行结合，反应后通过激光检测球形基质的色彩编号可以对不同的检测反应加以区分，既具有定性或定量的特点，又具有高通量的优点，因而可更加省时省力，同时节约了检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种液相芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种手足口病相关 病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于分子生物学技术及临床检测技 术领域。(二)
技术介绍
手足口病(hand-foot -mouth disease, HFMD)又名发疹性口腔炎，是由肠道 病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要 特征的一种急性常见传染病。儿童多发，3岁及3岁以下婴幼儿更容易得病。HFMD传染性强，传播途径复杂，传播快，在短时间内即可造成大流行。引起HFMD的病原体主要为微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道属的柯 萨奇病毒(Coxsackie virus) A组的2、 4、 5、 7、 9、 10、 16型，柯萨奇病毒B组的 1、 2、 3、 4、 5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯 萨奇病毒A组16型(CA16)与肠道病毒71型(EV71)。不同型别肠道病毒感染导致 的HFMD病情也各不相同。与CA16和ECH0等肠道病毒相比，EV71型引起的HFMD重症 感染的比例较大，可引起脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、疱疹性 咽峡炎、神经源性肺水肿、肺出血、病毒性心肌炎等多种疾病。重症患儿病死率 可达10%至25%。目前HFMD实验室诊断常用方法为血清学中和实验，病原学细胞接种，分子生 物学逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或real-time RT-PCR (rRT-PCR)等，这些 方法一次只能检测一种病毒，在实际应用过程中对于病毒谱的检测既繁琐又需要 相对大量的试剂和临床标本，检测费用高，因此如果能运用新的技术将这些病毒 进行同时检测，将会对这一类疾病的诊疗提供极大的方便。目前日益成熟的生物 芯片技术的高通量的特点可以实现多种病毒的一次性的联合检测。液相芯片技术 是生物芯片的一种，它除了具有普通生物芯片(即固相芯片)高通量的特点外， 还具有固相芯片不具有的高稳定性、高敏感性等优点，因此手足口病相关病毒平行检测液相芯片的研制和开发迎合了目前实验室和临床诊断的需要。(三)
技术实现思路
根据引发手足口病相关病毒多样化的特点，针对目前手足口病检测采用的 ELISA、 RT-PCR和real-time RT-PCR等方法一次只能检测一种病毒技术的不便、繁琐费时和实验室及临床诊断的需要，本专利技术要解决的问题是提供一种手足口病 相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用，不仅可以同时检测引发手足口 病的多种病毒，而且检测迅速，准确，省时省力，有利于实现手足口病的早发现、 早诊断和早治疗。本专利技术是通过如下技术方案实现的本专利技术的手足口病相关病毒平行检测液相芯片，主要由微球，特异性探针，生物素化的通用引物，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是26、 36和 46号微球；所述特异性探针是针对EV71、 CoxA16和Echo9病毒VPl区域的氨基化的 特异性探针，通用引物是经活化的生物素标记的肠道病毒通用引物。其中所述EV71特异性探针与26号微球形成偶联体，CoxA16特异性探针与36 号微球形成偶联体，Echo9特异性探针与46号微球形成偶联体；所述偶联体是一种 球形基质。以红色激光激发球形基质上的红色分类荧光，依据球形基质的色彩不同确定类 型；所述通用引物的生物素标记与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻 红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上 结合的手足口病相关病毒核酸的的含量。本专利技术共确定了3种用于手足口病诊断的针对VP1区域的特异性的探针，并利用 所述探针分别检测其相应的病毒核酸，分别是EV71病毒核酸、CoxA16病毒核酸 和Echo9病毒核酸。本专利技术所涉及的3种针对手足口病相关病毒VP1区域的特异性探 针，是在大量临床应用的基础上，证实确与手足口病的发生有密切关系而选择的。优选的，所述生物素化的通用引物是经过活化生物素标记的针对肠道病毒 的通用引物。优选的，所述26、 36和46号微球是经洗涤、活化的羧基微球。 生物素化的通用引物用于扩增手足口病相关病毒核酸，同时将扩增的RT-PCR 产物标记上生物素，生物素标记可以将与液相芯片微球体结合的RT-PCR产物与检 测荧光偶联，间接将结合的RT-PCR产物的浓度与检测荧光的强度结合起来，从而 实现对每种病毒的浓度进行定量测定。本专利技术的设计思路是选择针对手足口病相关病毒VP1区域的特异性探针， 分别与不同色号的微球偶联，根据检测需要混合，初步制备出可对上述手足口病 相关病毒进行一次性平行检测的液相芯片。在应用时，加入待检病毒核酸RT-PCR 产物，目的PCR产物被微球上的特异性探针捕获，再加入链霉亲和素-藻红蛋白 (SA-PE)，病毒核酸RT-PCR产物上的生物素与链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE) 结合，最后通过液相芯片检测系统，实现对上述手足口病相关病毒的一次性定性 定量检测。本专利技术所述手足口病相关病毒平行检测液相芯片的制备方法，其步骤是 (1)特异性探针与微球偶联形成偶联体 分别选取26、 36和46号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；以上述顺序分别对 应地加入针对EV71、 CoxA16和Echo9病毒VPl区域的特异性探针；加入EDC混匀；室温下，以200 250 rpm的转速放在摇床上孵育120分钟；重复1 2次；用PBS-TBN 洗涤2 3次；得EV71特异性探针与26号微球形成偶联体，CoxA16特异性探针与36 号微球形成偶联体，Echo9特异性探针与46号微球形成偶联体；计数单位体积每种 微球偶联体的数，分别于4 'C条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合；(2) 手足口病液相芯片的制备将标记有不同探针的球形基质即特异性探针与微球偶联的偶联体混合，初步 得到本专利技术的手足口病相关病毒平行检测液相芯片。(3) 生物素化通用引物的选择 优选生物素化的通用引物是用于扩增手足口病相关病毒核酸。 通用引物的生物素标记，用于将链霉亲和素-藻红蛋白结合到微球上。 本专利技术所述手足口相关病毒平行检测液相芯片在制备实验室和临床检测试剂中的应用。利用本专利技术的手足口病相关病毒平行检测液相芯片，可以实现对多种手足口 病相关病毒的平行检测，即可同时检测3种肠道病毒，也可以根据实验室和临床需 要选择性的测量其中的几种病毒，方便不同的疾病的实验室和临床检测需要。本专利技术的方法由于将多种手足口病相关病毒的检测在一个反应体系中进行，不同的探针可以和不同的目的分子进行结合，反应后通过激光检测球形基质的色 彩编号可以对不同的检测反应加以区分，既具有RT-PCR或real-time RT-PCR检 测的定性或定量的特点，又具有高通量的优点，因而可更加省时省力，同时节约 了检测成本。 具体实施例方式实施例h探针与已知编号的微球的偶联1. 分别选取26， 36和46号羧基微球(Lurainex公司)，用漩涡震荡器振荡微 球悬液，时间20s，使微球混合均匀。2. 分别取上述各号羧基微球大约2乂103个，分别转移到离心管中，》8000Xg 离心2 min，沉淀羧基微球。3. 移走上清，加入IOO u 1 dH20，用漩涡震荡器振荡20 s重悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种手足口病相关病毒平行检测液相芯片，主要由微球，探针，生物素化的随机引物，链霉亲和素－藻红蛋白组成，其特征是：所述微球是２６、３６和４６号微球；所述探针是针对ＥＶ７１、ＣｏｘＡ１６和Ｅｃｈｏ９病毒ＶＰ１区域的氨基化的特异性探针；所述生物素化的随机引物是经活化的生物素标记的针对肠道病毒的通用引物；所述探针能ＥＶ７１、ＣｏｘＡ１６和Ｅｃｈｏ９病毒核酸的ＶＰ１区域特异性的结合，所述生物素化的随机引物能对肠道病毒进行特异性的扩增；　其中：所述ＥＶ７１氨基化的特异性探针与２６号 微球形成偶联体，ＣｏｘＡ１６氨基化的特异性探针与３６号微球形成偶联体，Ｅｃｈｏ９氨基化的特异性探针与４６号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李忠，张华宁，吕慧，王显军，毕振强，张国宁，张凯宁，汪朝晖，李艳艳，
申请(专利权)人：山东省疾病预防控制中心，山东艾克韦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]