重组胎盘生长因子的表达生产、分离纯化及其化学标记制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域－重组基因工程领域。胎盘生长因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＰＬＧＦ）在血管新生或增生中起着重要作用；但体内天然的ＰＬＧＦ含量低且半衰期短，故很难提取到足够量的内源ＰＬＧＦ蛋白以满足日益增长的实验研究及临床需要。本发明专利技术公开了一种以重组基因工程，细胞培养技术在体外高效表达生产重组ＰＬＧＦ的系统及以层析分离技术从表达的上清液中提取纯化ＰＬＧＦ蛋白的方法。本发明专利技术还公开了一种对纯化的ＰＬＧＦ蛋白进行体外非放射性化学偶联标记处理的方法。本发明专利技术的ＰＬＧＦ蛋白（包括未标记的或化学偶联标记的）在实验研究及临床诊疗上具有广泛的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术-重组基因工程领域，涉及以基因工程及真核细胞发酵培养技术来 表达生产具生物活性的重组胎盘生长因子(placental growth factor, PLGF)。本专利技术还涉 及重组PLGF蛋白的分离纯化、体外化学标记与其应用。
技术介绍
血管增生或新生(angiogenesis)是指体内的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或 分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚 胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多 病理变化(如肿瘤的增生扩散、炎症反应等)息息相关。体内的血管能够不断地增生与增 长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。 血管内皮细胞的增生受体内正(即刺激血管增生)、负(即抑制血管增生)两大方面因子的 调控。其中正面调控血管内皮细胞增生的最为重要的因子为血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor,以下简称VEGF)及胎盘生长因子(placental growth factor,以下简称PLGF)。VEGF (包括VEGF-A， B， C， D及E等)、PLGF (包括PLGF-1， PLGF-2及PLGF-3) 与血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)—起，共同构成PDGF 家族成员。PDGF家族蛋白之间有相似的氨基酸序列及结构，其共同特征在于其N-端含有 高度保守的带8个半胱氨酸残基的多肽序列。PDGF家族蛋白主要以二聚体可溶性糖蛋白 形式存在于细胞外间质或体液中，并通过与表达在血管内皮细胞上的带酪氨酸激酶的特异 受体结合而介导出包括如促血管内皮细胞分裂增生、趋化迁移及血管通透性增强等一系列 的生物活性。目前已知的VEGF/PLGF的特异受体主要有三种即VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase,简称FLT-1) ; VEGFR-2 (Kinase-insert Domain Rec印tor，简称KDR; 在小鼠中称为Flk-1)和VEGFR-3 (简称FLT_4)。 其中VEGF-A可与VEGFR-1及VEGFR-2 受体结合；而VEGF-B和PLGF仅与VEGFR-1受体结合。VEGF及PLGF两者同源，且其结构与生物活性相近，但以往的研究更为关注的是VEGF。 而对于PLGF，尽管其基因早在1991年就已克隆出(Maglione D et al. PNAS 1991， 88:9267-9271)，但其在血管增生中的意义长时期以来一直是处于从属或未定状态。近年来随着研究的深入，越来越多的结果证明PLGF实际上参与许多生理或病理条件下的血管增 生。支持该结论的证据至少包括以下几点1) PLGF除了在胎盘中高水平表达之外，体内 其他组织器官(如肺脏等)及细胞中也检测到PLGF基因的表达；2) PLGF基因剔除的小鼠 其在外伤或移植肿瘤后所诱发的血管新生比其在正常小鼠中明显降低(Carmeliet P et al ， Nature Medicine 2001,7:575-583); 3)血液或尿液中PLGF及其可溶性FLT-1受体(即 VEGFR-1)蛋白的水平与高危妊娠妇女中的先兆子癫的发生与发展密切相关；4)动物体内 实验己证明注射抗-PLGF的抗体后，肿瘤的生长可得到控制(Fischer C et al. Cell 2007， 131:463-475)。因此，PLGF及其受体应是一很好的药物靶点或系统，可用于研究开发各 种与血管增生有关的疾病的药物制剂。但是在以PLGF及其受体为靶点的药物研发领域，目前还存在一些技术难题。其中一大 技术难题是由于体内天然的PLGF含量低且半衰期短，故很难从组织细胞或其他常规生物样 品(如血浆中)提取与分离到足够量的PLGF蛋白以满足日益增长的实验及临床研究的需要。 解决该问题的理想方案是以基因工程技术在真核细胞或原核细菌中表达生产重组的PLGF 蛋白。在原核细菌中表达生产重组PLGF蛋白的技术方案只见有个别文献报导。如在一份专利技术者青 周, 周群敏, 徐一清, 罗师平, 胡红群 申请人:苏州思坦维生物技术有限责任公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以重组基因工程、细胞培养及层析技术来表达及分离提取重组胎盘生长因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＰＬＧＦ）蛋白的系统方法，其特征在于其包括下列步骤：　１）以多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从细胞或组织中克隆获得含 编码ＰＬＧＦ蛋白的ｃＤＮＡ；　２）扩增获得的ｃＤＮＡ经限制性内切酶处理后，再用Ｔ４连接酶将其与经相应的限制性内切酶处理的表达载体相连，获得重组表达载体；　３）将上述重组表达载体转入真核宿主细胞，经筛选、扩增及诱导培养后获得高效稳 定分泌表达重组ＰＬＧＦ蛋白的宿主细胞；　４）收集表达宿主细胞培养上清液，经离心及滤膜过滤后，将滤液上样至离子交换层析柱中；　５）层析柱先经洗脱液清洗后，再以回收洗脱液洗脱并收集洗脱下的蛋白；　６）收集洗脱的蛋白再经调节ｐＨ 至中性及透析与理化鉴定后，即获得纯化的重组ＰＬＧＦ蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周群敏，周青，罗师平，胡红群，徐一清，
申请(专利权)人：苏州思坦维生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]