一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法技术

技术编号:37806889 阅读:16 留言:0更新日期:2023-06-09 09:36
本发明专利技术公开一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法,包括:样本稀释液、试纸条;所述试纸条由样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸、PVC底板、丝网印刷电极组组成,所述样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸依次设置在PVC底板上;所述NC膜上设有检测T线和质控C线;所述PVC底板上设有凹槽,用于放置丝网印刷电极组,该丝网印刷电极组置于检测T线正下方。本发明专利技术采用电化学发光原理进行检测的层析试纸条,不仅拥有层析试纸条所具备的使用简便、检测快速的特点,而且拥有电化学发光免疫分析法所具备的灵敏度高、线性范围宽、准确度高;可通过CCD相机采集发光信号从而进行全血、血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。

【技术实现步骤摘要】
一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法


[0001]本专利技术涉及,特别涉及一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法。

技术介绍

[0002]三联吡啶钌[Ru(bpy)2+3]电化学发光(Electrochemiluminescence,简称ECL)具有原位响应、检测灵敏度高、线性范围宽、信号干扰低等优点,在免疫检测领域得到了广泛应用。与吖啶酯化学发光、鲁米诺/ALP化学发光、ABEI化学发光等化学发光法相比,电化学发光灵敏度更高、重复性更好。
[0003]急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是一种临床常见的心脏疾病,病因是心肌缺血性坏死造成急性冠状动脉闭塞和血流中断。因其较高的致死率和危害性,AMI的准确诊断具有相当重要的临床价值。目前监测AMI的特异性心肌标志物有肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK

MB)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)。其中cTnI的心肌特异性最优,且在AMI发生后,心肌组织中的心肌肌钙蛋白I(cTnI)被迅速的释放到血液中并能保持5

10天的时间窗口,因而可作为心脏损伤前筛查,也是AMI诊断最有效的途径之一。通常认为cTnI在血液中的浓度大于0.5ng/mL时出现心肌损伤,AMI患者血液cTnI通常在1

25ng/mL的范围内。
[0004]心肌肌钙蛋白I(cTnI)在心肌组织中表达,在胎儿、健康人或疾病状态下的成人骨骼肌中不表达,因而对心肌具有高度特异性。于1994

1995年被美国国家食品与药品管理局(FDA)批准应用于临床急性心肌梗死(AMI)的诊断。肌钙蛋白(Tn)属于调节蛋白,由三个亚单位组成,即肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)及肌钙蛋白T(TnT)。TnI是一种碱性蛋白,由209个氨基酸组成,是一个延伸分子,采取反向平行与TnC形成二元复合物。TnC是钙离子受体,参予调节细丝的活化过程。TnT是一种非对称性蛋白质,伴有一球形C端功能区,它有一个与原肌球蛋白结合的位点。cTnI以不同形式存在于心肌细胞中,如以游离形式存在于胞浆内cTnI只占很少部分,大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合以复合体形式存在。当心肌损伤时,外周血中cTnI主要以cTnI

TnC复合物形式居多(90%以上)。cTnI

cTnT复合物仅发现存在于50%以下病人的血中,因此,检测的重要性远不如cTnI

cTnC复合物;其他形式的cTnI(如氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式)较少。当心肌细胞膜的完整性受破坏,cTnI先从胞浆内释放,因此,血清水平很快升高,而结合的cTnI由于相对分子质量大,从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放。心肌损伤后,外周血中心肌肌钙蛋白I一般在5~8h出现增高,在12~24h达最高值,且高水平往往维持7~10d。
[0005]cTnI的测定始于20世纪80年代中期,多采用放射免疫法和ELISA测定法。在20世纪90年代末期,当时的cTnI和cTnT试剂可以检出患者体内ng/mL级的肌钙蛋白。这种灵敏度水平的试剂仅能在缺血症状如胸痛发作3

6小时后可靠地检测到肌钙蛋白。这使得肌钙蛋白只能作为AMI的晚期标志物。而现在超敏肌钙蛋白检测系统的灵敏度可以达到pg/mL,能检
出任何形式的心肌损伤,包括发病1

3小时的AMI患者,节省的3小时黄金时间更有利于迅速进行患者管理。超敏肌钙蛋白检测使得肌钙蛋白成为AMI的早期标志物。目前对cTnI的检测多采用化学发光法,用化学发光物质标记抗cTnI抗体大大提高了对cTnI测定的精确性和敏感性。
[0006]cTnI测定方法包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附(ELISA)法、胶体金法、荧光免疫层析法和化学发光免疫分析法等。常规化学发光免疫分析法检测cTnI需要配套使用较大型设备、检测存在潜在的交叉污染、试剂在液态下的运输和储存稳定性受到很大限制,而且通常集中在检验科使用会导致样本的流转时间延长;胶体金法或荧光免疫层析法等床旁检测cTnI,虽然检测更为简便,但检测灵敏度低、测量范围窄、准确度较差。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题,本专利技术提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒及其测定方法,采用该方法可通过CCD相机采集发光信号从而进行全血、血清或血浆中心肌肌钙蛋白I含量测定。
[0008]为了实现上述目的,本专利技术提供一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,包括:样本稀释液、试纸条;所述试纸条由样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸、PVC底板、丝网印刷电极组组成,所述样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸依次设置在PVC底板上;所述NC膜上设有检测T线和质控C线;所述PVC底板上设有凹槽,用于放置丝网印刷电极组,该丝网印刷电极组置于检测T线正下方;所述检测T线包被有T线抗体,所述质控C线包被有C线抗体;所述结合物垫含有包被了cTnI抗体的三联吡啶钌负载介孔硅球免疫复合物颗粒。
[0009]优选的,所述样品垫的头部还与结合物垫的尾部粘贴,所述结合物垫的头部与NC膜尾部粘贴,所述NC膜头部与吸水纸尾部粘贴。
[0010]优选的,所述样本稀释液包括3%

5%甘露醇、2%

6%三丙胺的20

100mM四硼酸钠缓冲液,且PH=8.45

8.55。
[0011]优选的,所述样品垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜,该样品垫的制备过程:选用玻璃纤维膜或者聚酯膜材料,放置在样品垫预处理液中充分浸泡,待其饱和后从液体中捞出,然后在37℃的烘箱中烘干6

12h,得到所需样品垫。
[0012]优选的,所述样品垫预处理液包括3%

5%抗RBC(鼠源性)、1%

2%BSA、0.2%

1%酪蛋白、0.1%

1%曲拉通X

100的50mM HEPES缓冲液。
[0013]优选的,所述结合物垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜,该结合物垫的制备过程:选用玻璃纤维膜或聚酯膜等材料,经结合物垫处理液预处理后烘干,然后将制备好的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒用免疫复合物稀释液稀释后,均匀的喷在结合物垫上,然后在37℃烘箱中烘干6

12h,得到所需的结合物垫。
[0014]优选的,所述负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒制备过程:
[0015]步骤X1,负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球的制备:将500μL10mg/mL的羧基化介孔硅球放入5mL棕色玻璃瓶中,放入磁力搅拌子进行旋转搅拌;
[0016]再加入50

200μL 5mg/mL的[Ru(bpy)<本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,其特征在于,包括:样本稀释液、试纸条;所述试纸条由样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸、PVC底板、丝网印刷电极组组成,所述样品垫、结合物垫、NC膜、吸水纸依次设置在PVC底板上;所述NC膜上设有检测T线和质控C线;所述PVC底板上设有凹槽,用于放置丝网印刷电极组,该丝网印刷电极组置于检测T线正下方;所述检测T线包被有T线抗体,所述质控C线包被有C线抗体;所述结合物垫含有包被了cTnI抗体的三联吡啶钌负载介孔硅球免疫复合物颗粒。2.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,其特征在于,所述样品垫的头部还与结合物垫的尾部粘贴,所述结合物垫的头部与NC膜尾部粘贴,所述NC膜头部与吸水纸尾部粘贴。3.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,其特征在于,所述样本稀释液包括3%

5%甘露醇、2%

6%三丙胺的20

100mM四硼酸钠缓冲液,且PH=8.45

8.55。4.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,其特征在于,所述样品垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜,该样品垫的制备过程:选用玻璃纤维膜或者聚酯膜材料,放置在样品垫预处理液中充分浸泡,待其饱和后从液体中捞出,然后在37℃的烘箱中烘干6

12h,得到所需样品垫;所述样品垫预处理液包括3%

5%抗RBC、1%

2%BSA、0.2%

1%酪蛋白、0.1%

1%曲拉通X

100的20

100mM HEPES缓冲液。5.根据权利要求1所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,其特征在于,所述结合物垫的材料包括玻璃纤维膜或聚酯膜,该结合物垫的制备过程:选用玻璃纤维膜或聚酯膜等材料,经结合物垫处理液预处理后烘干,然后将制备好的包被cTnI抗体1的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒用免疫复合物稀释液稀释后,均匀的喷在结合物垫上,然后在37℃烘箱中烘干6

12h,得到所需的结合物垫。6.根据权利要求5所述的电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白I的试剂盒,其特征在于,所述负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球免疫复合物颗粒制备过程:步骤X1,负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球的制备:将500μL 10mg/mL的羧基化介孔硅球放入5mL棕色玻璃瓶中,放入磁力搅拌子进行旋转搅拌;再加入50

200μL 5mg/mL的[Ru(bpy)
32+
],在室温下避光搅拌12

24h;再将上述溶液置于1.5mL EP管中,于RCF=9,000

10,000
×
g条件下离心10

25min,取出去除上清,加入500μL纯化水,超声分散;再重复上述操作2次,然后用100μL纯化水重悬,得到负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球,并置于2

8℃条件下保存;步骤X2:负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球抗体标记:取50μL步骤X1中所得的负载三联吡啶钌的羧基化介孔硅球,加入950μL纯化水,混匀后于RCF=9,000

10,000
×
g条件下离心15

30min,弃上清;然后加入800μL的50mM MES缓冲液,混匀后加入50

200μL的20mg/mL EDC溶液、50

200μL的10mg/mL sulfo

NHS溶液,室温下...

【专利技术属性】
技术研发人员:张小海单博文董婷陈玮张继明
申请(专利权)人:深圳市雷诺华科技实业有限公司
类型:发明
国别省市:

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