一种利用指纹图谱检测黄鱼鳔的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用指纹图谱检测黄鱼鳔的方法，包括以下步骤：步骤1：黄鱼鳔供试品溶液的制备；步骤2：精密定量吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤3：将步骤2中获得的黄鱼鳔指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次黄鱼鳔供试品色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，采用平均值计算法生成黄鱼鳔的对照指纹图谱；步骤4：对黄鱼鳔指纹图谱中的典型共有峰进行液相制备分离纯化，获得代表性多肽成分；步骤5：基于液质联用分析代表性多肽，根据质谱碎裂特点及碎片离子信息与数据库进行比对，从而实现样品的表征。本发明专利技术所提供的黄鱼鳔指纹图谱，能全面、客观地表征黄鱼鳔的质量，能够用于鱼鳔品种的真伪鉴定。伪鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种利用指纹图谱检测黄鱼鳔的方法


[0001]本专利技术属于动物多肽检测
，涉及一种中药材的检测方法，特别涉及一种黄鱼鳔指纹图谱的建立方法以及利用其标准指纹图谱进行检测的方法。

技术介绍

[0002]鱼鳔具有滋补肝肾，补精益阳，润肺健脾，补气养血，活血止血，散瘀消肿，息风解痉，解毒敛疮等功效；其与燕窝、鱼翅齐名，为“海洋八珍之一”，被誉为“海洋人参”。目前已被北京、山东、湖南、甘肃等地方中药材标椎所收载，药用鱼鳔为石首科大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼、鮸鱼、中华鲟、鳇鱼或匙吻鲟科白鲟等的鳔，目前市场流通量最大的为黄鱼鳔。以上地方中药材标准中，鱼鳔的质量控制仅有性状鉴定、水分、总灰分检查、及总氮含量测定，无法有效控制鱼鳔质量。
[0003]动物药成分复杂，个别成分的定性定量分析难以全面反应药品的全面信息，且至今未有鱼鳔系统的化学成分及药效物质基础的研究报道。因此，建立能够全面反应鱼鳔质量的指纹图谱，并鉴定出其中具有代表性的成分，对于鱼鳔的质量控制具有重要意义。鱼鳔中蛋白质含量丰富，而蛋白质在特定的条件下经酶解或化学降解后得到的肽片段具有特征性及专一性，对其进行分离、分析获得的肽谱图可详细反应蛋白质的相关信息。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种精密度高、重复性和稳定性好的利用指纹图谱检测黄鱼鳔的方法，利用本专利技术建立的指纹图谱可以快速、准确的鉴定黄鱼鳔的质量，并进一步通过对黄鱼鳔的代表性多肽成分进行准确的分析，为有效控制鱼鳔质量提供重要手段。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术优化了样品前处理方法及色谱条件，建立了黄鱼鳔HPLC
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ELSD指纹图谱，并进一步对黄鱼鳔的代表性多肽成分进行了准确的分析，可用于全面客观评价黄鱼鳔的质量。
[0006]本专利技术采取的具体技术方案为：
[0007]一种利用指纹图谱检测黄鱼鳔的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008]步骤1、黄鱼鳔供试品溶液的制备：取不同批次的黄鱼鳔供试品，分别称取一定重量的供试品置于容器中，加水于4℃条件下泡发，供试品与水的质量体积比为1:100～1:200，破壁机匀浆，氢氧化钠调节pH＝7～7.5，加胰酶酶解，酶活力为3～5U/g，37℃，100～200r/min条件下震荡恒温酶解3h，酶解液煮沸10min灭活，酶解液离心，取上清液，减压浓缩，用体积百分数为0.05～0.15％甲酸水转移，C18固相萃取柱进行除盐处理；
[0009]步骤2、分别精密吸取步骤1中的供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；
[0010]步骤3、将步骤2中获得的黄鱼鳔供试品指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次黄鱼鳔色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成黄鱼鳔的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；结果应符合
以下标准：供试品指纹图谱中共18个共有峰，供试品图谱与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算软件计算，相似度不低于0.9。
[0011]进一步的，本专利技术还包括以下步骤：
[0012]步骤4、对黄鱼鳔指纹图谱中的典型共有峰：4号峰、17号峰，采用与步骤2相同的液相色谱条件进行液相制备分离纯化，获得代表性多肽成分；
[0013]步骤5、基于液质联用分析步骤4获得的代表性多肽成分，以三重四级杆质谱作为检测器，电喷雾离子源为ESI
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，采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据质谱碎裂特点及碎片离子信息与数据库进行比对，实现样品多肽成分的表征。
[0014]所述步骤1供试品溶液的制备方法中C18固相萃取柱除盐处理流程为：乙腈活化，用体积百分数为0.05％～0.15％的三氟乙酸水溶液平衡，上样，用两倍柱体积的体积百分数为0.05％～0.15％三氟乙酸水溶液淋洗，3倍柱体积的30％乙腈水(内含体积百分数为0.05％～0.15％的三氟乙酸)溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣加30％乙腈水(内含体积百分数为0.05％～0.15％的甲酸)溶液复溶，离心，取上清液，即得。
[0015]所述步骤2中，液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温30～40℃；以A：甲酸乙腈
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B：甲酸水为流动相，梯度洗脱，洗脱梯度为0～67min，0％～100％ A；流速0.9～1.1mL
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min
‑1，进样体积为1～20μL，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器进行检测，蒸发光散射检测器参数：漂移管温度110～120℃，载气流速2.5～3.5mL
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min
‑1；或安捷伦1260蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器参数：漂移管温度：40～45℃，载气压力：3.0～3.5bar，Gain：6～7。
[0016]作为优选方案，所述A：甲酸/乙腈
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B：甲酸/水流动相中甲酸体积比为：0.05％～0.15％；进一步地，所述A：甲酸/乙腈
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B：甲酸/水流动相中甲酸体积比为：0.1％。
[0017]所述步骤3中，供试品指纹图谱中共18个共有峰，以4号参照物峰相应的色谱峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间应符合：1号峰0.561～0.563，2号峰0.630～0.632，3号峰0.772～0.775，S峰1.000，5号峰1.579～1.586，6号峰2.738～2.749，7号峰4.076～4.095，8号峰4.275～4.296，9号峰4.464～4.489，10号峰4.608～4.747，11号峰5.238～5.260，12号峰5.482～5.508，13号峰8.326～8.366，14号峰8.591～8.628，15号峰8.780～8.822，16号峰9.058～9.100，17号峰9.274～9.319，18号峰10.528～10.580；各共有峰与S峰取LOG值后的相对峰面积应符合：1号峰0.796～0.869，2号峰0.846～0.950，3号峰0.885～0.973，S峰1.000，5号峰0.831～0.904，6号峰0.914～1.006，7号峰0.991～1.073，8号峰0.949～1.007，9号峰0.960～1.044，10号峰0.956～1.029，11号峰0.988～1.073，12号峰0.973～1.051，13号峰1.059～1.135，14号峰1.097～1.177，15号峰1.042～1.141，16号0.970峰～1.033，17号峰1.051～1.124，18号峰0.889～0.968。
[0018]所述步骤5中，对代表性多肽进行靶向二级碎裂表征，所述液质联用条件为：
[0019]使用EASY
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nLCTM1200纳升级UHPLC系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(15cm
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150μm，1.9μm)，柱温35℃；流动相A：含0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用指纹图谱检测黄鱼鳔的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、黄鱼鳔供试品溶液的制备：取不同批次的黄鱼鳔供试品，分别称取一定重量的供试品置于容器中，加水于4℃条件下泡发，供试品与水的质量体积比为1:100～1:200，破壁机匀浆，氢氧化钠调节pH=7～7.5，加胰酶酶解，酶活力为3～5U/g，37℃，100～200r/min条件下震荡恒温酶解3h，酶解液煮沸10min灭活，酶解液离心，取上清液，减压浓缩，用体积百分数为0.05～0.15%甲酸水转移，C18固相萃取柱进行除盐处理；步骤2、分别精密吸取步骤1中的供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温30～40℃，以A：甲酸/乙腈
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B：甲酸/水为流动相，梯度洗脱，洗脱梯度为0～67 min，0%～100% A；流速0.9～1.1 mL
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‑1，进样体积为1～20μL，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器进行检测，蒸发光散射检测器参数：漂移管温度110～120℃，载气流速2.5～3.5mL
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‑1；或安捷伦1260蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器参数：漂移管温度：40～45℃，载气压力：3.0～3.5bar，Gain：6～7；步骤3、将步骤2中获得的黄鱼鳔供试品指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次黄鱼鳔色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成黄鱼鳔的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；结果应符合以下标准：供试品指纹图谱中共18个共有峰，供试品图谱与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算软件计算，相似度不低于0.9，且所述供试品指纹图谱中的18个共有峰，以4号参照物峰相应的色谱峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间应符合：1号峰0.561～0.563，2号峰0.630～0.632，3号峰0.772～0.775，S峰1.000，5号峰1.579～1.586，6号峰2.738～2.749，7号峰4.076～4.095，8号峰4.275～4.296，9号峰4.464～4.489，10号峰4.608～4.747，11号峰5.238～5.260，12号峰5.482～5.508，13号峰8.326～8.366，14号峰8.591～...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡淑曼，杨雪，杨文哲，张鹏，魏宝红，马晓青，孙皓岩，管华诗，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：