一种老年痴呆症小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种老年痴呆症小鼠模型的构建方法，包括：S1.采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点插入CAG

【技术实现步骤摘要】
一种老年痴呆症小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于动物模型构建
，尤其涉及一种老年痴呆症小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]人巨细胞病毒(HCMV)属于疱疹病毒β亚科，为线状双链DNA病毒，在人群中感染率高达100％，具有潜伏感染的生物学特性。即刻早期蛋白2(IE2，又称UL122)是HCMV感染后最先表达的基因之一，作为转录因子，能够转录和激活其他病毒相关基因的表达。研究发现，IE2蛋白通过神经干细胞维持失调和迁移神经元的极化来干扰大脑发育。
[0003]由于中枢神经系统对HCMV普遍易感，感染后的中枢神经系统对HCMV感染的促炎反应可能是慢性神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)的一个促进因素。
[0004]阿尔茨海默病(AD)是一种隐匿的进行性神经退行性疾病，其特征是进行性记忆丧失和认知障碍(学习和记忆功能受损)，淀粉样蛋白β(Aβ)斑块沉积，神经元内形成神经原纤维缠结和神经炎症。
[0005]我国现有1000多万阿尔茨海默患者，是患者数量最多的国家。据2020年发布的《中国阿尔茨海默病患者家庭生存状况调研报告》预测，到2050年中国阿尔茨海默患病人数将超过4000万。
[0006]经过多年的研究，β淀粉样蛋白(Aβ)被认为是促进阿尔茨海默病发展的一种关键蛋白。这种蛋白在大脑中聚集形成的斑块，会造成神经细胞的变性和死亡，无论是在阿尔茨海默病患者还是各种用于研究神经退行性疾病的动物模型中，都是一个标志性的病理特征。
[0007]因此，当前亟需开发一种具备人老年痴呆疾病的临床特点和病理变化特点的动物模型，以用作研究人老年痴呆症的发病机理、药物和疫苗的有效工具。

技术实现思路

[0008]最近的研究表明，人巨细胞病毒感染与AD病理学和认知障碍有关，但具体机制尚不清楚。由于物种特异性的限制，无法在动物模型中进行HCMV与AD之间相关性的研究。因此，目前未见对HCMV在AD发生和发展中的具体作用机制的研究。
[0009]本专利技术的目的在于：克服物种特异性的局限性，构建一种老年痴呆症小鼠模型，使得IE2蛋白只在小鼠的大脑中表达，在其他组织中不表达，为HCMV
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IE2蛋白导致AD的发生与发展提供理想的研究模型。
[0010]以下，为了便于描述，对本专利技术中的一些名称或术语进行定义或说明。
[0011]即刻早期蛋白2(IE2，又称UL122)是HCMV感染后最先表达的基因之一，作为转录因子，能够转录和激活其他病毒相关基因的表达。IE2对细胞生长控制的扰动可能是病毒促进某些疾病发展的方式之一，例如智力低下和小头畸形。研究发现，IE2蛋白通过神经干细胞维持失调和迁移神经元的极化来干扰大脑发育。
[0012]Rosa26是一个位于小鼠6号染色体上由三个外显子构成的非编码基因，因为该区域极易进行基因插入操作，且由于其尚未发现功能性表达蛋白，加之容易进行同源重组，插入该区域的蛋白可以很好的进行表达，不会影响其他内源性基因的表达和功能发挥，在所有细胞类型和发育阶段均有广泛表达，所以小鼠的Rosa26位点常常被用作基因打靶的安全位点。
[0013]CAG是哺乳动物细胞中表达的强启动。
[0014]LSL：loxp
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Stop
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loxp，终止转录盒的存在可以阻止转基因的表达，如本专利技术步骤S2中与表达Cre小鼠交配的方式，可以通过同源重组去除终止转录盒(STOP casscatte)序列。
[0015]WPRE：woodchuck hepatitis virus post
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transcriptional regulatory，可促进RNA加工事件并增强病毒和转基因RNA的核输出，并增强转基因在靶细胞中的表达。
[0016]pA：polyA，多聚腺苷酸加尾信号。
[0017]CamkII
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Cre小鼠：将含有编码camk2α启动子，编码Cre重组酶的序列和SV40多腺苷酸化位点序列的8.5kbp序列的转基因构建体注射到受精的BCF1卵中。将所得的雄性转基因小鼠繁殖为C57BL/6小鼠，然后回交到C57BL/6小鼠十代。转基因在钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子的α亚基的控制下指导Cre重组酶的表达。
[0018]CamkII(钙/钙调素依赖性蛋白激酶II，CaM激酶II或CaMK2)是一种广泛存在于大脑中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是突触后密度(PSD)的主要组成部分。这种酶是一种寡聚蛋白质，由不同但相关的亚单位α、β、γ和δ组成，每个亚单位由一个单独的基因CAMK2A与其他CAMK2亚基组装成异寡聚物。
[0019]为了实现所述的专利技术目的，本专利技术提供了一种老年痴呆症小鼠模型的构建方法，其中，所述小鼠模型具有IE2蛋白表达的大脑组织特异性，所述构建方法包括：
[0020]S1.构建条件性IE2过表达的转基因小鼠：采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点插入CAG
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LSL
‑
IE2
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WPRE
‑
pA表达框，构建IE2转基因的F1代小鼠；
[0021]S2.构建大脑组织特异性表达IE2蛋白的小鼠：将所述F1代小鼠与CamkII
‑
cre小鼠交配获得F2代小鼠，并对所述F2代小鼠进行表型筛选，获得大脑组织特异性表达IE2蛋白的小鼠，即所述老年痴呆症小鼠模型。
[0022]根据本专利技术提供的构建方法，其中，所述老年痴呆症小鼠模型的海马与大脑皮层中Aβ和P
‑
tau蛋白表达水平升高。
[0023]根据本专利技术提供的构建方法，其中，所述步骤S1可以包括以下步骤：
[0024]步骤S1
‑
1.通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA(为定位酶切位点及准确切割做准备)，其中，所述gRNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示；
[0025]步骤S1
‑
2.通过In
‑
Fusion cloning的方法构建同源重组载体donor vector(构建表达载体)；
[0026]步骤S1
‑
3.将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠(目的基因的插入)；
[0027]步骤S1
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4.PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠(获取转基因阳性鼠)。
[0028]根据本专利技术提供的构建方法，其中，步骤S1
‑
2中所述同源重组载体donor vector
包含3.3kb 5
’
同源臂、CAG
‑
LSL
‑
IE2
‑
WPRE
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种老年痴呆症小鼠模型的构建方法，其中，所述小鼠模型具有IE2蛋白表达的大脑组织特异性，所述构建方法包括：S1.构建条件性IE2过表达的转基因小鼠：采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点插入CAG
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LSL
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IE2
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WPRE
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pA表达框，构建IE2转基因的F1代小鼠；S2.构建大脑组织特异性表达IE2蛋白的小鼠：将所述F1代小鼠与CamkII
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cre小鼠交配获得F2代小鼠，并对所述F2代小鼠进行表型筛选，获得大脑组织特异性表达IE2蛋白的小鼠，即所述老年痴呆症小鼠模型。2.根据权利要求1所述的老年痴呆症小鼠模型的构建方法，其中，所述小鼠模型的海马与大脑皮层中Aβ和P
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tau蛋白表达水平升高。3.根据权利要求1所述的老年痴呆症小鼠模型的构建方法，其中，所述步骤S1包括以下步骤：S1
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1.通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，其中，所述gRNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示；S1
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2.通过In
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Fusion cloning的方法构建同源重组载体donor vector；S1
‑
3.将...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，王志飞，张现娟，王韵阳，刘俸君，南福龙，于猛，
申请(专利权)人：青岛万明赛伯药业有限公司，
类型：发明
国别省市：