一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA疫苗及其制备方法，涉及核酸疫苗领域。本发明专利技术成功制备了一种表达猫细小病毒蛋白的mRNA疫苗，构建包含猫细小病毒VP2蛋白的mRNA载体质粒，并用于制备加帽修饰的mRNA，结合脂质体包裹方案制备mRNA疫苗，并应用于猫泛白细胞减少症的预防。该方法在猫泛白细胞减少症研究和疫苗创制上具有应用价值，能够大力推进疫苗的转化应用。苗的转化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及核酸疫苗领域，具体而言涉及一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA疫苗，包含猫细小病毒VP2蛋白mRNA疫苗的制备。

技术介绍

[0002]猫泛白细胞减少症(feline panleukopenia，FP)是由猫细小病毒(Felineparvovirus，FPV)引起的猫的一种急性、高度接触性传染病。FPV感染的典型临床症状是双相热、呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞严重减少和出血性肠炎。主要感染1岁以内的幼猫，通常情况下，对1岁以下的猫的致死率为50％～60％，对5月龄以下的幼猫的死亡率高达80％～90％。如果母猫在怀孕期感染该病毒，则造成死胎、流产等症状。最初于20世纪90年代由Verge首次鉴定出该病毒，之后在加拿大、美国、日本等许多国家都有发现，我国在1985年首次分离到该病毒，之后张振兴和李刚等人报道在河北、河南、浙江等地均有猫细小病例的发生。该病在世界上广泛存在，被认为是猫重要的传染病之一。FPV宿主广泛，除感染家猫外，还能感染其他猫科动物(如虎、豹)、鼬科动物(如貂)及熊科(如浣熊)严重危害宠物猫及野生猫科动物的生命健康。FPV属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)，是一种能够自我复制的无囊膜的单股正链DNA病毒。FPV病毒粒子约为20
‑
30nm，呈等轴对称的正二十面体。FPV基因组长约5Kb，包括一个长的编码区域和两端由独特的回文结构组成，回文序列碱基配对形成发卡双链体，编码区主要编码两个主要的开放阅读框，分别编码非结构蛋白NS(NS1和NS2)和病毒结构蛋白VP(VP1和VP2)。
[0003]VP2蛋白约占所有结构蛋白的90％，VP1蛋白占所有结构蛋白的10％，因此VP2蛋白是FPV编码的主要的抗原蛋白，在免疫应答、识别受体及感染组织的过程中发挥着重要作用。VP2蛋白的三级结构主要由Loop1
‑
Loop5这5个环形结构围绕8个反向平行的反折叠片构成的三折叠单元纤突、肩部和顶部形成的，与病毒的血凝特性和致病性密切相关。其中Loop3是组成病毒三折叠蛋白单元纤突的肩部，不直接参与病毒衣壳蛋白对转铁蛋白受体的识别，而是在立体空间上对提高病毒的感染效率。VP2蛋白上有多个抗原识别位点，能够刺激机体产生中和抗体，起到免疫保护作用。由VP2蛋白组成的病毒样颗粒可以用于制备多种病毒的候选疫苗，对该病毒的复制及感染宿主的范围具有一定的决定作用，并且能够很好的诱导体液和细胞免疫。
[0004]相比传统疫苗，mRNA疫苗作为新型疫苗的形式，具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低。相较与DNA疫苗，mRNA疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，半衰期可以通过修饰进行调整。mRNA疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可以诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有宠物疫苗产品中存在的不足，提供了一种预防或治疗猫泛白细胞
减少症的表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA疫苗制备方法及其应用。
[0006]本专利技术的技术方案：
[0007]一种重组mRNA合成质粒，包括质粒骨架序列、编码猫细小病毒VP2蛋白的基因；所述编码猫细小病毒VP2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]其中，猫细小病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)属于细小病毒科病毒(Panleukopenia)，主要感染1岁以内的幼猫，引起双相热、呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞严重减少和出血性肠炎。
[0009]其中，FPV的VP2蛋白拥有大部分中和抗体表位，是主要的抗体免疫点。VP2蛋白上有多个抗原识别位点，能够刺激机体产生中和抗体，起到免疫保护作用。
[0010]所述质粒骨架序列包括T7启动子序列、5
’
UTR区、3
’
UTR区和3
’
末端PolyA尾。可构建于任意克隆载体，PolyA尾末端保留一个限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。优选的，所述限制性内切酶位点为BspQ I、Bsa I或Mlu I。
[0011]委内瑞拉马脑炎病毒复制酶1
‑
4编码区；编码猫杯状病毒VP2蛋白基因序列经过密码子优化。VEE复制酶基因nsp 1
‑
4区，包含VEE病毒复制酶基因序列，表达的VEE病毒复制酶能够在体内合成mRNA，起到复制mRNA的功能。
[0012]本专利技术还提供了所述的重组mRNA合成质粒在制备预防猫细小病毒感染引起的猫泛白细胞减少症的疫苗中应用。
[0013]本专利技术还提供了一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA，包括5
’
UTR区、3
’
UTR区和3
’
末端PolyA尾、编码猫杯状病毒VP2蛋白的mRNA；所述猫杯状病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]还包括委内瑞拉马脑炎病毒复制酶1
‑
4编码区的mRNA。
[0015]优选的，还包含5
’
帽结构，所述5
’
帽结构为7
‑
甲基鸟苷帽结构。
[0016]其中，表达VP2蛋白的基因mRNA序列大小为2018bp(序列如SEQ ID NO.3所示)，表达VP2蛋白的基因复制型mRNA序列大小为9528bp(序列如SEQ ID NO.4所示)。
[0017]本专利技术还提供了一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA疫苗，包含所述表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA。
[0018]目前，mRNA疫苗主要以两种序列结构存在，传统的非复制型mRNA序列和自扩增型(复制型)的mRNA疫苗序列。自扩增型mRNA序列含有复制酶基因，可在细胞内扩增mRNA，从而以较少的mRNA剂量生产较多的抗原。非复制型的mRNA疫苗结构简单，在人体内无法自我复制，需要成熟的优化工艺才能在较低的剂量诱发有效的免疫应答。
[0019]本专利技术还提供了所述的mRNA疫苗的制备方法，将所述表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA与阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇脂质和胆固醇混合制备成脂质纳米颗粒，通过微流控装置或混合透析后获得所述复制型mRNA疫苗。
[0020]具体步骤为：
[0021](1)将重组mRNA合成质粒T7
‑
VP2使用限制性内切酶进行线性化处理；
[0022](2)对线性化的T7
‑
VP2质粒利用T7启动子序列进行体外转录反应，提纯获得VP2
‑
mRNA；
[0023](3)对获得VP2
‑
mRNA使用牛痘病毒加帽酶和2
′‑
O
‑
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组mRNA合成质粒，其特征在于，包括质粒骨架序列、编码猫细小病毒VP2蛋白的基因；所述编码猫细小病毒VP2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的重组mRNA合成质粒，其特征在于，所述质粒骨架序列包括T7启动子序列、5
’
UTR区、3
’
UTR区和3
’
末端PolyA尾。3.如权利要求2所述的重组mRNA合成质粒，其特征在于，所述3
’
末端Poly A尾包含一个用于质粒线性化制备的限制性内切酶位点。4.如权利要求1所述的重组mRNA合成质粒，其特征在于，还包括委内瑞拉马脑炎病毒复制酶1
‑
4编码区；编码猫杯状病毒VP2蛋白基因序列经过密码子优化。5.如权利要求1
‑
4所述的重组mRNA合成质粒在制备预防猫细小病毒感染引起的猫泛白细胞减少症的疫苗中应用。6.一种表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA，其特征在于，包括5
’
UTR区、3

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永乐，黄耀伟，唐建斌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：