一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立方法技术

本发明专利技术提供了一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立方法。指纹图谱的建立方法包括：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)指纹图谱的建立。本发明专利技术方法结合HILIC

【技术实现步骤摘要】
一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立方法


[0001]本专利技术涉及中药检测
，尤其涉及一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立方法。

技术介绍

[0002]《中国药典》2015年版一部收载的黄精规定的来源为：本品为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。按形状不同，习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。被国家卫生和计划生育委员会认定为按照传统既是食品又是中药材的药食同源中药材，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效，常用于抗疲劳、调节免疫、降血糖、降血脂等，具有极高的药用保健价值。由于黄精功效确切、市场认可度好、价格较高，因此市场上常有用黄精属的其他植物，如湖北黄精、四川黄精等，冒充黄精进行销售的现象，严重影响黄精产业发展。而导致这种冒充现象难以杜绝的一个重要原因，便是因为黄精的药材标准不够明确，方法专属性差，难以通过现有药材标准快速的评价不同来源黄精质量方面所存在的问题，因此急需围绕黄精中药材技术标准进行研究，以形成更加明确、更有区分度的标准。
[0003]另外根据研究发现，黄精中糖的种类丰富，但是糖的含量分布并不均匀，多糖作为黄精的主要化学成分，测定其含量、判断其纯度是评估黄精多糖质量控制方面不可缺少的重要手段。然而常采用的苯酚
‑
硫酸法，准确性低且无法获取多糖的结构信息，故而对于市场上不同来源的黄精多糖质量无法进行有效评估。虽然目前部分酸水解方法简单易行，已广泛应用于中药多糖的降解。但与酶解相比，部分酸水解产物一般比较复杂，均一性较差。酶法水解条件温和、特异性强。
[0004]如对比文献，名称为“基于PMP
‑
HPLC和化学计量学的黄精基原物种多糖差异分析”，该方法采用水提醇沉法提取黄精药材中的多糖，经三氟乙酸(TFA)水解和1
‑
苯基
‑3‑
甲基
‑5‑
吡唑啉酮(PMP)柱前衍生后，采用HPLC建立3种黄精的色谱指纹图谱；并利用相似度(SA)分析，聚类分析(HCA)和主成分分析方法(PCA)对指纹图谱进行分析，研究3种基原黄精物种多糖的差异，但该方法存在以下缺陷：(1)采用了1
‑
苯基
‑3‑
甲基
‑5‑
吡唑啉酮(PMP)衍生剂进行了柱前衍生反应，会引起过多的物质成分，对柱子和检测存在负面影响，精密度差及可控性差；(2)该方法样品制备过程较复杂，时间长，成本高；(3)从该研究多糖色谱指纹聚类分析来看，滇黄精与多花黄精和黄精多糖组分差异明显，而黄精与多花黄精二者多糖指纹图谱相对滇黄精，二者之间的色谱指纹差异稍小，通过聚类分析无法将其区分；与主成分分析结论不一致；该方法可靠性差。
[0005]因此，基于酶解的方式对中药多糖进行研究更具方向性、目的性和可控性。本研究利用HPLC
‑
HILIC
‑
ELSD对黄精多糖的酶水解产物进行了进一步研究。此外，HILIC模式结合ELSD技术，对寡糖进行分离和检测，结果所有的峰都被分离，峰形状良好，分辨率高。且通过采用化学计量学方法，包括HCA(系统聚类分析)、PCA(主成分分析)和PLS
‑
DA(偏最小二乘判别分析)对多种黄精多糖(PCPs)的色谱数据进行融合、处理和分析，验证了本方法的准确性
及可靠性。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立及化学模式识别方法，该方法操作简便、准确可靠；采用酶解方法对于黄精多糖进行水解，筛选出了适用于黄精的果糖苷酶，并且优化了酶解条件及方法；检测出了黄精多糖中的特异性寡糖片段，酶法水解条件温和、特异性强，水解反应更具有方向性、目的性和可控性；采用了更适用于多糖中寡糖片段分离的蒸发光检测器，与HILIC色谱柱相结合，最终黄精多糖指纹图谱可达到17个色谱峰；构建了黄精多糖的指纹图谱，经方法学及化学计量学方法验证，本专利技术指纹图谱稳定可靠；在一定程度上解决了目前市场四川黄精、湖北黄精等黄精易混品的鉴别难题。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0008]一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
[0009](1)对照品溶液的制备：取果糖、蔗糖、葡萄糖对照品适量，精密称定，转移至容量瓶中，加水定容至刻度，即得；
[0010](2)供试品溶液的制备：取适量的黄精多糖与果糖苷酶溶液混合，置于振荡器中水解，并加热，离心，取上清液，干燥，用乙腈/水溶液溶解，即得；
[0011](3)指纹图谱的建立：采用高效液相色谱仪，对照品溶液和供试品溶液检测，记录色谱图，建立对照品和供试品溶液的指纹图谱；其色谱条件如下：
[0012]色谱柱：Hypersil GOLD
TM
PEI HILIC HPLC，型号为：5μm，250mm
×
4.6mm；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱；柱温：35℃；流速：1.0mL
·
min
‑1；检测器：蒸发光检测；进样量10μL；
[0013]梯度洗脱条件：0～25min，85％～65％ A；25～35min，65％～50％A。
[0014]本专利技术步骤(1)所述对照品溶液的制备为：取果糖、蔗糖、葡萄糖对照品各10mg，精密称定，转移至10mL容量瓶中，水定容至刻度，即得。
[0015]本专利技术步骤(2)所述供试品溶液的制备为：取黄精多糖，加水制成浓度为0.5mg/mL的黄精多糖溶液，加入等体积的果糖苷酶溶液混合，置于振荡器中水解，并加热，离心，取上清液，干燥，用500μL乙腈/水溶液溶解，即得。
[0016]本专利技术步骤(2)中所述果糖苷酶溶液的浓度为：50
‑
200U/mL。
[0017]优选的，本专利技术步骤(2)中所述果糖苷酶溶液的浓度为：100U/mL。
[0018]本专利技术步骤(2)中所述加热为：在80℃下加热20分钟。
[0019]本专利技术步骤(2)中所述振荡器的设置条件为：温度为55℃，转速为200转/分钟，时间为1
‑
7小时。
[0020]优选的，本专利技术步骤(2)中所述振荡器的设置条件为：温度为55℃，转速为200转/分钟，时间为3小时。
[0021]本专利技术步骤(2)中所述离心的设置条件为：4500r/min，15min。
[0022]本专利技术步骤(2)中所述乙腈/水溶液为：体积比1:1。
[0023]本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0024]1、本专利技术采用酶解的方法对黄精多糖进行水解，筛选出了适用于黄精的果糖苷
酶，并且优化了酶解条件及方法，得到酶浓度为100U/mL时，聚合度更高的寡糖的色谱峰更多；水解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄精基原物种多元指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备：取果糖、蔗糖、葡萄糖对照品适量，精密称定，转移至容量瓶中，加水定容至刻度，即得；(2)供试品溶液的制备：取适量的黄精多糖与果糖苷酶溶液混合；将混合物在振荡器中水解，并加热，离心，取上清液，干燥，用乙腈/水溶液溶解，即得；(3)指纹图谱的建立：采用高效液相色谱仪，对照品溶液和供试品溶液检测，记录色谱图，建立对照品和供试品溶液的指纹图谱；其色谱条件如下：色谱柱：Hypersil GOLD
TM
PEI HILIC HPLC，型号为：5μm，250mm
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4.6mm；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱；柱温：35℃；流速：1.0mL
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‑1；检测器：蒸发光检测；进样量10μL；梯度洗脱条件：0～25min，85％～65％A；25～35min，65％～50％A。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述对照品溶液的制备：取果糖、蔗糖、葡萄糖对照品各10mg，精密称定，转移至10mL容量瓶中，水定容至刻度，即得。3.根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚中，蒲婧哲，胡冲，刁卓，徐凡，
申请(专利权)人：安徽省食品药品检验研究院安徽国家农副加工食品质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：