本发明专利技术涉及一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，属于生物工程领域。C5/C6共利用酿酒酵母的木糖代谢与鲁棒性之间往往存在此消彼长的拮抗现象，本发明专利技术采用协同指数（Synergy Index，SI）定量表征C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，该指数是乙醇得率比值（RYe/xT，ratio of ethanol yield from xylose to theoretical value）与存活率（Survival rate under stress，SRS）的乘积（即SI=RYe/xT
【技术实现步骤摘要】
一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法
[0001]本专利技术涉及一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，属于生物工程领域。
技术介绍
[0002]随着世界经济的不断发展，各国对能源的需求日益增加，传统的化石能源因储量有限，污染环境等缺点，已无法满足当前的社会需求，亟需开发环境友好型可再生资源。利用地球上最丰富的可再生有机资源——木质纤维素生产二代燃料乙醇具有特殊的战略意义，因其主要以农业废弃物和其他非粮作物为原料，避免了“与人争粮、与粮争地
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的问题，契合当前我国“双碳”目标背景下的现实需求。
[0003]木质纤维素主要由纤维素、 半纤维素以及木质素组成，其中，纤维素是由D
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葡萄糖单元通过β
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1,4
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糖苷键连接而成的线性聚合物，经完全水解生成D
‑
葡萄糖单体，部分水解为纤维二糖、纤维三糖及低聚糖等；半纤维素是指纤维素以外的碳水化合物（少量果胶和淀粉除外），由两种或多种单糖残基组成，具有分支化且无定形特点，其完全水解可生成五碳糖（如木糖、阿拉伯糖等）和六碳糖（如半乳糖、葡萄糖、甘露糖等）以及4
‑
O
‑
甲基葡萄糖醛酸等多种糖单体；木质素是一种芳香族化合物，其苯基丙烷单元通过醚键和碳碳键以非线性的方式连接在一起，木质素与半纤维素共价结合，这种复杂的结构增加了植物细胞壁的强度，导致木质纤维素原料很难被酶或微生物直接利用，因而需要对其进行必要的预处理和酶解，以释放可以被微生物直接利用的糖类组分。然而，预处理过程在破坏纤维素结构的同时，不可避免地产生一系列抑制物，如弱酸类（如甲酸、乙酸及乙酰丙酸等）、呋喃类衍生物（如糠醛、5
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羟甲基糠醛（HMF）等）和酚类抑制物（如4
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羟基苯甲醛、丁香醛、愈创木酚及香草醛等），这些抑制物能够抑制代谢酶的活性和破坏细胞膜结构稳定性，严重抑制细胞生长并降低糖代谢能力，特别是木糖代谢能力。因此，依据木质纤维素水解液组分特点，发酵微生物在性能上必须具备两个特点，即具有高效的五碳糖/六碳糖（C5/C6）共利用能力和对抑制物具有较高的鲁棒性。
[0004]酿酒酵母由于具有较高的发酵葡萄糖产乙醇能力， 同时具有较好的抗逆性，基因操作技术成熟，被认为是转化木质纤维素水解液生产燃料乙醇的最具潜力的工业菌株之一，然而由于天然酿酒酵母本身缺乏与木糖代谢有关的酶，所以只能利用葡萄糖，而不能或仅少量非特异性利用木质纤维素原料中含量丰富的木糖，并且，木质纤维素原料在预处理及酶解过程中产生的多种抑制物严重降低了酿酒酵母的发酵性能和乙醇得率，因此，因此，提高酵母的葡萄糖木糖高效同步共利用能力和鲁棒性是利用酿酒酵母高效转化燃料乙醇的基本要求。近几十年来，研究人员通过木糖代谢途径引入、强化磷酸戊糖途径（PPP途径）等内源性下游途径、弱化旁支途径及能源消耗节点等策略，来提高酿酒酵母的糖醇转化率。通过许多理性改造包括改变酶的定向进化基因、转录因子的遗传调控、嘌呤生物合成途径的调控、在抑制物条件下适应性进化等手段，来提高酿酒酵母的对抑制物耐受性。
[0005]越来越多的研究随着木糖利用能力的增强，菌株对抑制物的耐受性降低； 提高菌株对抑制物的耐受性的同时，其木糖代谢能力也随之下降。如Demeke等报道对木糖利用能力较差、鲁棒性较强的酿酒酵母进行代谢工程改造，菌株的木糖比消耗速率由0.13 g/g DW/h提升至1.1 g/g DW/h，改造后菌株的木糖代谢能力显著提高，但对HMF和乙酸的耐受性明显降低，改造前后菌株的木糖代谢与鲁棒性之间呈现此消彼长现象[Demeke MM, Dumortier F, Li Y, Broeckx T, Foulqui
é‑
Moreno MR, Thevelein JM. Combining inhibitor tolerance and D
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xylose fermentation in industrial Saccharomyces cerevisiae for efficient lignocellulose
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based bioethanol production. Biotechnology for biofuels, 2013, 6(1): 120
‑
120.]。本课题组前期通过理性代谢工程及适应性进化工程构建了一株C5/C6高效共利用重组酿酒酵母菌株LF1，其糖醇转化率可达0.472 g/g， 为理论值的 92.5%[ Li H, Shen Y, Wu M, Hou J, Jiao C, Li Z, Liu X, Bao X. Engineering a wild
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type diploid Saccharomyces cerevisiae strain for second
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generation bioethanol production. Bioresour Bioprocess. 2016, 3(1):51.]，但在含较高抑制物浓度的玉米秸秆水解液中鲁棒性较差。为了进一步提高其鲁棒性，又对LF1菌株进行ARTP诱变，采用含有60%预处理液的筛选培养基筛选，然后在含有50%预处理液的培养基和纯木糖培养基（YPX）中交替驯化，筛选得到突变菌株LF1
‑
6M，该菌株对单一或混合抑制物的耐受性有所提高，但木糖代谢能力有所降低；为了进一步恢复菌株的木糖代谢能力，对LF1
‑
6M进行ARTP 迭代诱变，利用木糖唯一碳源的培养基进行厌氧条件筛选，最终得到突变株 6M
‑
15，其对单一抑制物和混合抑制物耐受性均得到明显提高，在YPX中的木糖比消耗速率与 LF1 相近，其葡萄糖和木糖共发酵产乙醇的性能和木糖利用率恢复到与LF1相当，此外在pH为3.5的高抑制物浓度的木质纤维素水解液中，能有效地转化葡萄糖和木糖，说明6M
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15保留了良好的木糖利用能力，表现出更好的鲁棒性，其木糖代谢能力和鲁棒性之间的拮抗现象得到缓解[Wei Fangqing, Li Menglei, Wang Ming, Li Hongxing, Li Zailu, Qin Wensheng, Wei Tian di, Zhao Jianzhi, Bao Xiaoming. A C6/C5 co
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fermenting Saccharomyces cerevisiae strain with the alleviation of antagonism between xylose utilization and robustness. Global Change Biology Bioenergy, 2020, 13(1): 83
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97.]。因此，在提高酿酒酵母菌株鲁棒性的同时往往损失木糖代本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，其特征在于，采用协同指数SI定量表征C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，协同指数SI是乙醇得率比值RYe/xT与存活率的乘积SRS；即SI=RYe/xT
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SRS。2.根据权利要求1所述的定量表征方法，其特征在于，所述RYe/xT是指在C5/C6共利用酿酒酵母以木糖为唯一碳源培养条件下进行限氧摇瓶发酵，利用木糖的实际乙醇得率与理论乙醇得率的比值，即RYe/xT =。3.根据权利要求2所述的定量表征方法，其特征在于，所述的理论乙醇得率为0.51 g g
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1 total xylose。4.根据权利要求1所述的定量表征方法，其特征在于，所述SRS是指C5/C6共利用酿酒酵母在含有抑制物的胁迫条件下的最大比生长速率（μ
max
）与在标准葡萄糖培养基中μ
max
的比值（即SRS =）。5.根据权利要求4所述的定量表征方法，其特征在于，所述抑制物，包括弱酸类抑制物、呋喃醛类抑制物、酚类化合物、阿魏酸、对香豆酸。6.根据权利要求1所述的定量表征方法，其特征在于，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）限氧摇瓶发酵：将C5/C6共利用酿酒酵母菌株分别接种至以木糖为唯一碳源的培养基、以葡萄糖为唯一碳源的标准培养基和含有抑制物的...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍晓明，徐丽丽，李晨豪，赵建志，韦方卿，袁嫒，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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