一种用于犬埃利希氏体的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种犬埃利希氏体荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括成套引物和探针，所述成套引物和探针是由第一引物、第二引物和探针组成；所述第一引物的核苷酸序列为序列表中序列1；所述第二引物的核苷酸序列为序列表中序列2；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。本发明专利技术的PCR检测试剂盒是基于犬埃利希氏体保守的16sRNA基因序列为靶序列设计上下游引物，并增加含荧光基团标记的探针，通过实时荧光定量PCR技术，建立PCR扩增体系，实现灵敏度为10拷贝/反应；大大提高的犬埃利希氏体的检测灵敏度和缩短了检测时间。测时间。测时间。

【技术实现步骤摘要】
一种用于犬埃利希氏体的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术实施例涉及兽医检测
，具体涉及一种用于犬埃利希氏体的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]犬埃利希氏体（Canine Ehrlichiosis）属于立克次体科犬埃利希氏体属，呈圆形、椭圆形或者杆状，革兰氏阴性。以单个或多个形式寄生于单核白细胞内和嗜中性粒细胞的胞质内膜空泡内。感染后可引起犬埃利希氏体病（Canine Ehrlichiosis），又称为犬的艾滋病，该病原体主要侵害犬的免疫系统，引发组织出血、多数脏器呈浆细胞浸润、血小板和血细胞减少。病原体以家犬、野犬和啮齿类动物为宿主，通过血红扇头蜱为传染媒介进行传播。感染后潜伏期7～12d。临床症状复杂多样，常见急性期患病犬以发热，食欲减退，精神萎靡，消瘦，体重变轻，结膜炎，淋巴结肿大，肺炎，四肢及阴囊水肿等为特征，腹部触诊可摸到脾肿大，经常伴有出血性疾病。偶见呕吐，呼出有恶臭味气体，腹泻。血检呈现过性的血细胞减少。1～3周后，即转为亚临床期，病犬临床症状不明显。慢性阶段可持续数月至数年，特征为各类血细胞减少、出血、贫血骨髓发育不良。如血细胞压积为10%～15%，白细胞低于6.0
×
109/L，血小板少于50
×
109/L；鼻出血，粪便带血，外伤出血不止；血清中丙种球蛋白增高，白蛋白/球蛋白比例降低；1/3犬血清碱性磷酸酶和丙氨酸转氨酶增高；1/4犬血清尿氮、肌酸酶和磷值升高；多数犬有氮血症。此外，病犬尿检可见尿蛋白，骨髓检查造血细胞减少。
[0003]目前实验诊断检测犬埃利希氏体的方法主要有：血液涂片法检验、病原分离培养法检验和血清学诊断。血液涂片法检验主要采取患犬初期或发热期的血液，涂片固定，采用姬姆萨氏染法染色光学显微镜下检查，可见紫色或黑色的犬埃利希氏体和膜样包裹的包涵体存在于单核白细胞和嗜中性粒细胞，该检测方法需要较高的技术水平，且主观性强极易出现误判的情况，对低丰度样本容易漏检，检测需要高浓度的病原体丰度。病原体分离法为取病犬急性期或发热期血液，分离白细胞，接种于DH82犬巨噬细胞或犬单核细胞培养。埃里希氏体在培养细胞内缓慢生长，培养1～2周后用电镜检查感染细胞胞质中的包涵体呈桑葚状结。培养法具有比血液涂片法的灵敏度高，但检测周期长，不适用病原体及时检测。
[0004]目前主要的检测方法是血清学检测，主要以ELISA和间接荧光抗体技术为主，通过包被犬埃利里希氏体抗原，用于检测犬血液样本中抗体，确定犬感染的情况，检测时间和灵敏度都得到了明显的提高，但操作步骤繁琐，且该检测方法对复杂血液容易因特异性差出现假阳性的问题。
[0005]综上所述，现有对犬埃利希氏临床检测主要以临床症状和血液常规检测为主，不能实际针对病原体本身进行检测，不能及时有效的检出犬埃利希氏的感染。此外，对于犬埃利希氏体的检测方法主要存在为检测周期长或准确性和特异性差的问题，亟待进一步改进。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术实施例提供一种用于犬埃利希氏体的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：本专利技术实施例提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒包括成套引物和探针，所述成套引物和探针是由第一引物、第二引物和探针组成；所述第一引物的核苷酸序列为序列表中序列1；所述第二引物的核苷酸序列为序列表中序列2；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。
[0008]本专利技术的一个实施例中，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。
[0009]本专利技术的一个实施例中，所述第一引物、第二引物和所述探针的配比为1
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5:1
‑
5:0.5
‑
3。
[0010]本专利技术的一个实施例中，所述第一引物、第二引物和所述探针的终浓度分别为400nM、400nM和200nM。
[0011]本专利技术实施例还提供上述所述的PCR试剂盒在如下1）
‑
3）中至少一种功能的产品中的应用，1）鉴定或辅助鉴定犬埃利希氏体；2）检测或者辅助检测待测菌体是否为犬埃利希氏体；3）检测或辅助检测待测样本是否含有犬埃利希氏体或犬埃利希氏体核酸。
[0012]本专利技术实施例所述的待测样本为离体粪便、全血、血清或血浆。
[0013]本专利技术实施例还提供一种检测或辅助检测待测菌体是否为犬埃利希氏体的方法，其包括以下步骤：用上述所述的PCR试剂盒对待测菌体进行荧光定量PCR，反应结束后通过扩增曲线和Ct值判断是否为犬埃利希氏体；若待测菌体有S型扩增曲线且Ct值≤38时，则待测菌体为犬埃利希氏体；若待测菌体Ct值＞38或者扩增产物不呈S型曲线、无Ct值时，所述待测菌体不为犬埃利希氏体。
[0014]本专利技术实施例还提供一种检测或辅助检测待测样本是否含有犬埃利希氏体的方法，用上述所述的PCR试剂盒对待测样品进行荧光定量PCR，反应结束后通过扩增曲线和Ct值判断待测样品是否感染犬埃利希氏体；若待测样品有S型扩增曲线且Ct值≤38时，则待测样品含有犬埃利希氏体；若待测样品Ct值＞38或扩增产物不呈S曲线、无Ct值时，所述待测样品不含有犬埃利希氏体。
[0015]本专利技术的有益效果：本专利技术的PCR检测试剂盒是基于犬埃利希氏体保守的16sRNA基因序列为靶序列设计上下游引物，并增加含荧光基团标记的探针，通过实时荧光定量PCR技术，建立PCR扩增体系，实现灵敏度为10拷贝/反应；大大提高的犬埃利希氏体的检测灵敏度和缩短了检测时间，实现了犬埃利希氏体检测速度更快，特异性更强，准确性和灵敏度更高的优化，对控制犬埃利希氏体感染、传播和及时防治均具有重要意义。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方
式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0017]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
能涵盖的范围内。
[0018]图1为本专利技术实施例提供的犬埃利希氏体基因组16S rRNA基因常规PCR扩增产物电泳图；图2为本专利技术实施例提供的引物对与探针筛选试验结果图；图3为本专利技术实施例提供的实施例6中实时荧光定量PCR标准曲线；图4为本专利技术实施例提供的实施例7中实时荧光定量PCR特异性试验图；图5为本专利技术实施例提供的实施例8中实时荧光定量PCR敏感性试验图；图6为本专利技术实施例提供的实施例10的稳定性试验结果图；图7为本专利技术实施例提供的实施例11的样本检测结果图。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括成套引物和探针，所述成套引物和探针是由第一引物、第二引物和探针组成；所述第一引物的核苷酸序列为序列表中序列1；所述第二引物的核苷酸序列为序列表中序列2；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。2.如权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。3.如权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述第一引物、第二引物和所述探针的配比为1
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5:1
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5:0.5
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3。4.如权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述第一引物、第二引物和所述探针的终浓度分别为400nM、400nM和200nM。5.权利要求1
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4中任一所述的PCR试剂盒在如下1）
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3）中至少一种功能的产品中的应用，1）鉴定或辅助鉴定犬埃利希氏体；2）检测或者辅助检测待测菌体是否为犬埃利希氏体；3）检测或辅助检测待测样本是...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵方圆，巩玉洁，王学君，赵荣茂，高晓龙，张琼林，袁婷婷，杨晓霞，陈娟，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：