微生物发酵法制备γ-聚谷氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物发酵法制备γ

【技术实现步骤摘要】
微生物发酵法制备
γ
‑
聚谷氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，尤其涉及一种微生物发酵法制备γ
‑
聚谷氨酸的方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
聚谷氨酸(γ
‑
PGA)是一种多聚氨基酸类的环保型多功能生物可降解高分子材料。作为一种高分子聚合物，γ
‑
PGA具有一些独特的物理、化学和生物学特性，如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底被生物降解，无毒无害，可食用等，可作为诸如保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等的原料，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广泛的应用前景。γ
‑
聚谷氨酸的合成方法主要有提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶转化法，目前γ
‑
聚谷氨酸的制备主要是利用微生物发酵法进行的，此方法具有工艺相对简单，产物的分离纯化相对容易的优点，但是发酵过程中γ
‑
聚谷氨酸的产量还有待提高。
[0003]申请号为202010536784.5的专利技术专利公开了一种利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ
‑
聚谷氨酸的方法，该方法还提供了聚谷氨酸合成酶，然后提供了聚谷氨酸合成酶的编码基因，接着提供了聚谷氨酸合成酶的核酸序列的重组表达载体和表达聚谷氨酸合成酶的重组菌的获得方式，该方法以微生物整体细胞作为反应催化剂，对外源底物进行结构修饰的微生物转化，合成静息游离细胞，具有反应条件温和、反应体系简单、反应时间短、转化率高、无污染，大大加速了目标产物γ
‑
聚谷氨酸的合成效率，而且产物分子量较均一，属于低分子量范围的γ
‑
聚谷氨酸。但是该方法投入成本大，不够经济。
[0004]申请号为200610122640.5的专利技术专利公开了γ
‑
聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ
‑
聚谷氨酸的方法，该专利技术提供的微生物菌株是经选育的γ
‑
聚谷氨酸(γ
‑
PGA)产生菌—枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBSTILIS)PGA
‑
7 CCTCC M 206102。其生产γ
‑
聚谷氨酸的方法,是用BACILLUSSUBSTILIS CCTCC M 206102做发酵菌株，利用糖质原料进行摇瓶发酵，在发酵原料中不需要添加L
‑
谷氨酸，这比以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物发酵，其原料成本有较大的降低；本专利技术在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ
‑
PGA最高可达18g/L，具有良好的工业化应用前景。但利用该方法存在生产γ
‑
聚谷氨酸的产量不够高的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于现有技术的存在的生产不经济和产量不高的问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种提高γ
‑
聚谷氨酸产量的经济的微生物发酵法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种微生物发酵法制备γ
‑
聚谷氨酸的方法，步骤如下：步骤1、活化菌种：用接种环挑取1~3环枯草芽孢杆菌菌种接种于平板活化培养基上，在35~38℃恒温静置培养11~13小时，得到活化菌种；
步骤2、种子液的制备：挑取2~5环步骤1制备的活化菌种，接种于种子培养基中，在35~38℃恒温振荡培养14~16小时，振荡转速为200~250转/分钟，得到种子液；将种子液稀释制成浓度为0.13~0.16亿/升的菌种悬浮液；步骤3、发酵液的制备：将步骤2制备的菌种悬浮液接种到发酵培养基中，加入经紫外灭菌的磁性氧化体/环氧树脂多孔复合材料，在35~38℃恒温振荡培养51~53小时，得到含γ
‑
聚谷氨酸的发酵液；步骤4、γ
‑
聚谷氨酸的提取：将步骤3得到的含γ
‑
聚谷氨酸的发酵液调节pH为3~4，以4000~6000转/分钟离心25~50分钟，取上清液，再加入
‑
1~3℃温度预冷20~40分钟的无水乙醇，在3~4.5℃以300~500转/分钟搅拌10~30分钟并静置14~16小时，接着继续以4000~6000转/分钟离心12~25分钟，收集沉淀，真空干燥8~16小时，再加入水中，以300~500转/分钟搅拌15~30分钟，在水中透析23~25小时，真空冷冻干燥10~24小时，得到γ
‑
聚谷氨酸。
[0007]优选的，所述平板活化培养基包括如下重量百分比原料：15~25g/L琼脂粉、8~12g/L大豆蛋白胨、3~8g/L牛肉膏、3~8g/L氯化钠、1~3g/L酵母粉、0.5~1.5g/L葡萄糖，溶剂为水，调节pH为7.5。
[0008]优选的，所述种子培养基包括如下重量百分比原料：25~35g/L蔗糖、25~35g/L谷氨酸钠、5~15g/L牛肉膏、0.25~0.75g/L三水合磷酸氢二钾、0.15~0.45g/L七水合硫酸镁，溶剂为水，调节pH为7.5。
[0009]优选的，步骤3所述接种量为3~15%mL/mL。
[0010]优选的，所述发酵培养基包括如下重量百分比原料：450~600mL/L酶解液、35~55g/L谷氨酸钠、4~10g/L牛肉膏、0.5~1.5g/L三水合磷酸氢二钾、0.15~0.35g/L七水合硫酸镁、0.05~0.15g/L氯化钠，溶剂为水，调节pH为7.5.优选的，所述发酵培养基装液量为120~180mL/500mL。
[0011]优选的，上述培养基pH利用浓度为1%~1.5wt%的磷酸氢二钾水溶液和浓度为0.08%~0.1wt%的磷酸二氢钾水溶液进行调节。
[0012]优选的，上述培养基均经121℃高温蒸汽灭菌18~25分钟处理。
[0013]优选的，所述磁性氧化体/环氧树脂多孔复合材料与发酵培养基质量和体积的比为0.3~1.6:9g/mL。
[0014]优选的，步骤4所述pH利用0.01~0.1mol/L盐酸调节。
[0015]优选的，步骤4所述加入水的体积与发酵培养基的体积的比为1~3:8~10。
[0016]优选的，所述透析截留分子量为50kD~100kD。
[0017]进一步优选的，所述酶解液制备方法为：将10~30重量份干料依次用浓度为4~8vt%醋酸水溶液、浓度为8~12wt%氢氧化钠水溶液、10~30重量份水进行浸泡处理，每次浸泡后用水清洗1~3次，浸泡处理完成后在119~125℃高温灭菌1.5~2.5小时，冷却至20~30℃，在浓度为40~60vt%的乙醇水溶液中洗涤2~4次，然后在100~110℃干燥8~12小时，得到预处理干料；将8~20重量份预处理干料与柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液混合，再加入纤维素酶、黑曲霉酸性蛋白酶，在35~38℃恒温酶解8~12小时，然后在98~110℃温度水浴10~15分钟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵法制备γ
‑
聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、活化菌种：用接种环挑取1~3环枯草芽孢杆菌菌种接种于平板活化培养基上，在35~38℃恒温静置培养11~13小时，得到活化菌种；步骤2、种子液的制备：挑取2~5环步骤1制备的活化菌种，接种于种子培养基中，在35~38℃恒温振荡培养14~16小时，振荡转速为200~250转/分钟，得到种子液；将种子液稀释制成浓度为0.13~0.16亿/升的菌种悬浮液；步骤3、发酵液的制备：将步骤2制备的菌种悬浮液接种到发酵培养基中，加入经紫外灭菌的磁性氧化体/环氧树脂多孔复合材料，在35~38℃恒温振荡培养51~53小时，得到含γ
‑
聚谷氨酸的发酵液；步骤4、γ
‑
聚谷氨酸的提取：将步骤3得到的含γ
‑
聚谷氨酸的发酵液调节pH为3~4，以4000~6000转/分钟离心25~50分钟，取上清液，再加入
‑
1~3℃温度预冷20~40分钟的无水乙醇，在3~4.5℃以300~500转/分钟搅拌10~30分钟并静置14~16小时，接着继续以4000~6000转/分钟离心12~25分钟，收集沉淀，真空干燥8~16小时，再加入水中，以300~500转/分钟搅拌15~30分钟，在水中透析23~25小时，真空冷冻干燥10~24小时，得到γ
‑
聚谷氨酸；所述发酵培养基以酶解液作为主要碳源；所述酶解液通过将豆粕、西谷椰子树木髓木屑经酸泡、碱泡、水泡洗后，用纤维素酶和黑曲霉酸性蛋白酶酶解得到；所述磁性氧化体/环氧树脂多孔复合材料制备方法如下：S1、将六水合硝酸镁、九水合硝酸铁加入水中，搅拌均匀，得到混合物A，然后在搅拌状态下，分3~5次将六亚甲基四胺加入混合物A中，继续搅拌至混合物A中溶液成透明状，然后在118~205℃反应9~11小时，接着自然冷却至20~30℃，收集固体，用水和无水乙醇分别洗涤，干燥，然后在650~750℃焙烧3.5~4.5小时，得到磁性氧化体；S2、将步骤S1制备的磁性氧化体和水混合，搅拌均匀，得到磁性氧化体分散液；然后将环氧树脂、碳化硅混合，搅拌，然后超声，加入固化剂，搅拌1~4分钟，接着加入磁性氧化体分散液，搅拌2~5分钟，固化成型，得到磁性氧化体/环氧树脂多孔复合材料。2.如权利要求1所述的一种微生物发酵法制备γ
‑
聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述平板活化培养基包括如下重量百分比原料：15~25g/L琼脂粉、8~12g/L大豆蛋白胨、3~8g/L牛肉膏、3~8g/L氯化钠、1~3g/L酵母粉、0.5~1.5g/L葡萄糖，溶剂为水，调节pH为7.5；所述种子培养基包括如下重量百分比原料：25~35g/L蔗糖、25~35g/L谷氨酸钠、5~15g/L牛肉膏、0.25~0.75g/L三水合磷酸氢二钾、0.15~0...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，盖丽丰，赵廷彬，马正旺，张琳，孙银华，牛思思，李振海，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：