肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法。本发明专利技术的肾小管类器官培养基对于肾小管类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的肾小管类器官，在体外较好的保留了患者来源的组织一致性和异质性，为进一步进行肾小管研究应用奠定了基础；本发明专利技术的肾小管类器官的培养方法，采用本发明专利技术的肾小管类器官培养基进行培养，能够有效的模拟肾小管组织，可为肾小管相关疾病发病机理、致病因素研究和正常肾小管组织药物毒性研究提供强大平台；本发明专利技术的培养方法步骤简便清晰，操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。养提供了便利条件。养提供了便利条件。

【技术实现步骤摘要】
肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法。

技术介绍

[0002]肾脏是人体的重要器官，能够清除体内代谢产物及某些废物、毒物，生成尿液，调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，可以生成肾素、促红细胞生成素等物质。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。其中，肾小管和肾小管间质构成肾脏的重要部分，并且是对损伤做出反应的主要部位，容易受到各种损伤，包括缺氧、感染、毒素、代谢紊乱和衰老的影响。越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞在肾脏修复或进展为慢性肾脏疾病中发挥着重要的作用。
[0003]为了了解肾小管相关的肾脏疾病，并将这一知识转化为临床应用，迫切需要有代表性和稳定的临床前肾小管模型。目前，最普遍的临床前模型是小鼠模型和二维培养的细胞系。然而，这两种模型存在许多缺陷，阻碍了其临床应用。细胞系无法体现患者的异质性，因而无法从根本上代表肾脏相关疾病的复杂性；而人源肿瘤异种移植虽然可以保持遗传和原始肾脏疾病的组织学特点，但是小鼠基因特性、生长环境等与肾脏病患者不尽相同，这在很大程度上导致了其应用的局限性。
[0004]类器官是一种新发展的体外三维培养技术，与常规细胞系培养相比，类器官培养系统形成的组织结构和功能较为复杂，具有拟合度高、传代稳定、培养周期短、成功率高等优势，是目前理想的体外培养模式。由于其保持了亲本组织的关键特征，可以利用类器官进行药物筛选、疾病建模等，对个性化治疗做出贡献。因此，肾小管类器官的构建，对于研究肾小管相关肾脏疾病具有重要的意义，然而目前并没有较好的肾小管类器官构建的技术方案。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提出了一种肾小管类器官培养基及肾小管类器官的培养方法，以解决或至少部分解决现有技术中存在的技术问题。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种肾小管类器官培养基，包括基础培养基、L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF
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β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂。
[0007]优选的是，所述的肾小管类器官培养基，还包括原代细胞抗生素和青霉素/链霉素双抗。
[0008]优选的是，所述的肾小管类器官培养基，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12基础培养基；
[0009]和/或，所述pH缓冲剂为HEPES缓冲剂；
[0010]和/或，所述抗氧化剂为N
‑
乙酰半胱氨酸；
[0011]和/或，所述血清替代物为B
‑
27supplement；
[0012]和/或，所述人重组蛋白为R
‑
Spondin
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3；
[0013]和/或，所述TGF
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β受体抑制剂为A83
‑
01；
[0014]和/或，所述生长因子包括EGF、FGF
‑
10；
[0015]和/或，所述ROCK抑制剂为Y27632。
[0016]优选的是，所述的肾小管类器官培养基，所述原代细胞抗生素为primocin。
[0017]优选的是，所述的肾小管类器官培养基，所述L
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丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺的浓度为1～3mM，所述HEPES缓冲剂的浓度为10～25mM、所述N
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乙酰半胱氨酸的浓度为0.5～2mM，所述B
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27supplement的体积浓度为1～2％，所述R
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Spondin
‑
3的浓度为200～250ng/mL，所述A83
‑
01的浓度为5～10μM，所述EGF的浓度为50～100ng/mL，所述FGF
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10的浓度为50～100ng/mL，所述Y27632的浓度为5～10μM，所述primocin的浓度为80～120μg/mL，所述青霉素/链霉素双抗的浓度为50～100IU/mL。
[0018]第二方面，本专利技术还提供了一种所述的肾小管类器官培养基在培养肾小管类器官中的应用。
[0019]第三方面，本专利技术还提供了一种肾小管类器官的培养方法，采用所述的肾小管类器官培养基进行培养。
[0020]优选的是，所述的肾小管类器官的培养方法，包括以下步骤：
[0021]获取肾组织样本；
[0022]对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀；
[0023]将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合，得到细胞溶液；
[0024]将细胞溶液与Matrigel基质胶混合，然后接种至孔板中，接种完成后，静置直至Matrigel基质胶凝固；
[0025]待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，即得肾小管类器官。
[0026]优选的是，所述的肾小管类器官的培养方法，对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀，具体包括以下步骤：
[0027]将肾组织样本剪碎后，使用含有青霉素/链霉素双抗的DPBS溶液清洗；
[0028]向清洗后的肾组织样本中加入胰酶消化液，并于37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱中消化40～50min，再加入AdvancedDMEM/F12基础培养基终止消化，再经过离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀。
[0029]优选的是，所述的肾小管类器官的培养方法，若所得肾细胞沉淀为红色，在将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合之前还包括：向沉淀中加入红细胞裂解液，孵育，再次离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀；
[0030]将细胞溶液与Matrigel基质胶混合的步骤中，细胞溶液与Matrigel基质胶的体积比为(1～2):(1～2)；
[0031]待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养的步骤中，培养调节为：37℃、体积浓度为5％的CO2环境下培养；
[0032]待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，每2～3d更换肾小管类器官培养基。
[0033]本专利技术的肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0034]1、本专利技术的肾小管类器官培养基，包括：基础培养基、L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF
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β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂；本专利技术的培养基对于肾小管类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的肾小管类器官，在体外较好的保留了患者来源的组织一致性和异质性，为进一步进行肾小管研究应用奠定了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肾小管类器官培养基，其特征在于，包括基础培养基、L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF
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β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂。2.如权利要求1所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，还包括原代细胞抗生素和青霉素/链霉素双抗。3.如权利要求1～2任一所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12基础培养基；和/或，所述pH缓冲剂为HEPES缓冲剂；和/或，所述抗氧化剂为N
‑
乙酰半胱氨酸；和/或，所述血清替代物为B
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27supplement；和/或，所述人重组蛋白为R
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Spondin
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3；和/或，所述TGF
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β受体抑制剂为A83
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01；和/或，所述生长因子包括EGF、FGF
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10；和/或，所述ROCK抑制剂为Y27632。4.如权利要求3所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，所述原代细胞抗生素为primocin。5.如权利要求4所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，所述L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺的浓度为1～3mM，所述HEPES缓冲剂的浓度为10～25mM、所述N
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乙酰半胱氨酸的浓度为0.5～2mM，所述B
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27supplement的体积浓度为1～2％，所述R
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Spondin
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3的浓度为200～250ng/mL，所述A83
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01的浓度为5～10μM，所述EGF的浓度为50～100ng/mL，所述FGF
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【专利技术属性】
技术研发人员：邵牧民，江徐，余学问，孙惠力，
申请(专利权)人：深圳市中医院，
类型：发明
国别省市：