检测细菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种检测细菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，包括以下步骤：（１）选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；（２）按一定摩尔比将细菌毒素模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；（３）利用电极表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。所述的痕量细菌毒素的检测方法为：将上述方法制得的糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。本发明专利技术所得到的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极特异性强，灵敏度高，检测速度快，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选，减少了检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境污染物检测
，具体地说涉及一种检测细菌毒素的糖基功能 化分子印迹膜电极的制备方法，及采用所述的糖基功能化分子印迹膜电极检测环境样本 中痕量细菌毒素的方法。
技术介绍
细菌毒素主要有三种外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性 蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时 就具有很高的毒性。目前细菌毒素已成为迫切需要治理的新一代环境污染物，微量的细 菌毒素即可对正常激素作用产生影响，干扰内分泌机能，引起哺乳动物及人类的生殖障 碍、发育异常及某些病理性损伤。这类物质不仅存在于工业废水、废气和生活污水中， 在农产品中也可能存在。如果细菌毒素残留不能得到及时、准确地检测，它们就可能进 入机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢，给人类健康带来严重的危害。因此，建立一种高灵敏度和特异性的快速筛检细菌毒素残留的方法，便成为当前该 研究领域亟需解决的问题之一。目前细菌毒素的检测分析方法主要有生物学方法，如 动物测毒法和细胞测毒法；免疫学方法，如有反向被动血凝实验(RPHA)、被动免疫 溶血试验(PIH)、毒素与抗毒素琼脂扩散试验、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附试验 (ELISA);分子生物学方法，如PCR法。这些检测方法虽然灵敏度较高，稳定性较好，但大多都有周期长，过程复杂，费时费力结果准确性低等缺点。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供了一种检测速度快、灵敏度高的检测细菌 毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法。本专利技术还提供了使用上述糖基功能化分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的所述的检测细菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特殊之处在于包 括以下步骤(1) 选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；(2) 按一定摩尔比将细菌毒素模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有 机溶剂混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；(3) 利用电极表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。所述细菌毒素模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比为o.i 2 : 2.5: o.i 5: 40 80 : o.oi o.io : i.o i5。所述功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神 经节苷脂或神经酰胺三已糖苷。所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲垸、 氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、杂环化合物酰胺或砜类；所述有机溶剂为二氯 甲垸或四氯化碳。所述将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面包括以下步骤(1) 将工作电极表面用0.05 pm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再依次用1 mol/LHN03， lmol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，晾干；(2) 将晾干的工作电极浸泡于糖基功能化分子印迹聚合物溶液中5-10分钟，再取出用洗 脱剂洗脱20-30分钟，直至将模板分子完全洗掉，然后在室温下干燥5-10分钟；(3) 重复步骤(2)4-7次，制得所述糖基功能化分子印迹膜电极。 将制得的糖基功能化分子印迹膜电极浸入pH6.8-7.5的缓冲液中，保存在4'C冰箱 12~24h，然后用去离子水彻底清洗。所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸。所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。 本专利技术所述的检测细菌毒素的方法，包括以下步骤将上述方法制得的糖基功能化 分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。 本专利技术的有益效果如下1.将表面修饰技术应用到糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备当中，使得糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确 性。2. 本专利技术所得到的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极，可以实现样本中细菌毒 素的高特异性、高灵敏度、快速检测。3. 本专利技术的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的特异性强，样品中其它非特异 性分子对检测结果无影响；灵敏度高，可以达到ng级；检测速度快，完成一个基本检 测过程仅需l-2分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选；成本低，检测 1个样品仅需几分钱。4. 糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法，操作快速简单，反应 及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便 于现场检测。附图说明图1为糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面过程示意图。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例1一种检测白喉毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，包括以下步骤(1) 选择能与白喉毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体A-D-吡喃 糖基甘露糖；(2) 将模板分子白喉毒素，功能单体A-D-吡喃糖基甘露糖，交联剂乙二醇二 甲基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔剂氯仿，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲垸按摩尔比为o.i : 2.5 : 0.5 : 70 : 0.05 : 2.0的比例混合均匀，得到糖基功能化白喉毒素分子印迹聚合物溶液；(3) 工作电极选用玻璃碳电极，将工作电极表面用0.05pm的氧化铝粉打磨， 超声波清洗，再分别用1 mol/LHN03， 1 mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清 洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；(4) 如图l所示将玻璃碳电极表面浸泡在糖基功能化白喉毒素分子印迹聚合物 溶液中5分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱工作电极表面20分钟，6直至把这一层中的模版分子白喉毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10 min，如此 循环，重复上述过程5次。(5)将玻璃碳电极浸入到pH 6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4'C的冰箱 中12h，以便除去电极表面过量的糖基功能化白喉毒素分子印迹聚合物，当电极用 去离子水彻底清洗以后，制备成功糖基功能化白喉毒素分子印迹膜电极。将制得白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样 品提取液中的白喉毒素进行检测，结果见表l。 实施例2 (破伤风毒素)一种检测破伤风毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，包括以下步骤(1) 选择能与破伤风毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体唾液酸 神经节苷脂；(2) 模板分子破伤风毒素，功能单体唾液酸神经节苷脂，交联剂三羟甲基丙烷 三甲基丙烯酸酯，致孔剂二氯甲烷，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲垸按摩尔比0.5 : 2.5 : 3 : 45 : o.i : 5，混合均匀，得到糖基功能化破伤风毒素分子印迹聚合物溶液；(3) 工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05nm的氧化铝粉打磨，超声 波清洗，再分别用1 mol/LHN03， 1 mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数 次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；(4) 将玻璃碳电极浸泡在糖基功能化破伤风毒素分子印迹聚合物溶液中10分 钟，然后将工作电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面25分钟，直至把这 一层中的模板分子破伤风毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10 min。如此循环， 重复上述过程6次。(5) 将上述玻璃碳电极浸入到pH 6.8的柠檬酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测细菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　（１）选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；　　　　（２）按一定摩尔比将细菌毒素模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；　　　　（３）利用电极表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，于京华，裴梅山，汪世华，葛慎光，林青，张秀明，邢宪荣，贺晓蕊，朱晗，孙纳新，宋晓妍，袁靓，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]