用于治疗糖尿病的经修饰的胰岛素和葡萄糖激酶核酸制造技术

本公开涉及编码胰岛素和葡萄糖激酶的经修饰核酸序列、包含其的表达盒和递送载体，以及用于递送其以治疗糖尿病的方法。及用于递送其以治疗糖尿病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗糖尿病的经修饰的胰岛素和葡萄糖激酶核酸
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年7月3日提交的第63/047,965号美国临时申请；2020年7月20日提交的第63/054,162号美国临时申请；2020年8月18日提交的第63/067,264号美国临时申请；2021年1月26日提交的第63/141,918号美国临时申请；和2021年5月14日提交的第63/188,788号美国临时申请的优先权权益，其各自在此都通过引用方式全文并入。对以电子方式递交的序列表的引用
[0002]以电子方式递交的ASCII文本文件(4525_016PC05_Seqlisting_ST25；大小：240,360字节；和创建日期：2021年6月30日)格式的序列表与本申请一起提交，该序列表的内容通过引用方式整体并入本文。

技术介绍

[0003]糖尿病的两种主要形式是1型(T1DM)和2型(T2DM)(Diabetes care,1997,20
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1183
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1197)。
[0004]T1DM的特征是由于胰腺β
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细胞的特异性破坏而导致胰岛素产生严重缺乏。T1DM中的β
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细胞丧失是自身免疫介导的过程的结果，其中称为胰岛炎的慢性炎症导致β
‑
细胞破坏(Eizirik D.L.等人,2001,Diabetologia,44:2115
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2133和Mathis D等人,2001,Nature,414:792
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798)。T1DM是儿童期最常见的内分泌和代谢病况之一；发病率正在迅速增加，尤其是在幼儿中。当自身免疫介导的β
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细胞破坏几乎完全导致患者需要胰岛素替代疗法才能生存时，就可以诊断为T1DM。成人中的T1DM可能表现出与T2DM相似，代谢控制缓慢恶化，随后进展为胰岛素依赖。这种形式称为成人潜伏性自身免疫糖尿病(LADA)(Diabetes Atlas第4版,2009,国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation))。
[0005]T2DM是糖尿病的最常见形式，并且已将其归因于遗传、环境和行为风险因素之间的相互作用。T2DM的特征是胰岛素不敏感、胰岛素产生减少和最终的胰腺β
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细胞衰竭(Olokoba,A.等人,2012,Oman Med.J.27(4):269
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273)。
[0006]终身胰岛素治疗通常是T1DM和T2DM两者的首选疗法。虽然使用外源性胰岛素进行终身治疗在控制糖尿病方面取得了很大成功，但由于难以维持严格血糖控制，糖尿病并发症仍可能发生。长期的高血糖状态可能导致严重的微血管或大血管并发症，最常见的表现为视网膜病变、神经病变、肾病、脑血管意外或心肌梗塞。通过改善血糖控制可以预防这些毁灭性并发症。值得注意的是，脆性糖尿病是一种特别不稳定的形式，即使终身使用外源性胰岛素也很难控制。
[0007]此外，在许多不发达国家，获得自我保健工具和胰岛素的机会可能受到限制，这可能导致糖尿病儿童出现严重残疾和早逝(Diabetes Atlas第4版,2009,国际糖尿病联盟,Beran D.等人2006,Lancet,368:1689
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1695和Gale E.A.等人,2006,Lancet,368:1626
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1628)。从全球角度来看，患糖尿病儿童最常见的死亡原因是缺乏获得胰岛素的机会。因此，在胰岛素获取机会受限的情况下，一次性基因治疗方法的可用性可以产生深远的影响(Greenwood H.L.等人,2006,PLoS Med 3.e381)。
[0008]降低高血糖和维持正常血糖是T1DM和T2DM的任何治疗方法的目标。目前对大多数糖尿病患者的疗法是基于定期皮下注射短效作用和长效作用胰岛素制剂。


[0009]本公开涉及医学领域，包括基因治疗组合物，该组合物包含编码胰岛素和/或葡萄糖激酶的经修饰核酸，用于治疗糖尿病。

技术实现思路

[0010]本公开的某些方面涉及编码人胰岛素(Ins)蛋白(例如，前胰岛素原或其变体)的多核苷酸，其包括(i)编码信号肽的核苷酸序列，任选地，其中信号肽不是野生型前胰岛素原信号序列，和(ii)编码胰岛素原多肽的核苷酸序列，相对于野生型胰岛素原中相应的氨基酸位置，该胰岛素原多肽包含在选自人胰岛素B链的氨基酸B10、B28和/或B29、人胰岛素C链的C1和/或C32或者其任意组合的位置处的氨基酸修饰，并且任选地，该多核苷酸进一步包括切割位点。在一些方面，信号肽是野生型前胰岛素原信号序列、IL
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6信号序列或纤连蛋白信号序列。在一些方面，切割位点是弗林蛋白酶切割位点。
[0011]本公开的某些方面涉及包含编码人胰岛素(Ins)蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸包含开放阅读框(ORF)，该ORF包含：(i)编码信号肽的核苷酸序列和(ii)与SEQ ID NO:43
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57、110
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116、150
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151、154
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155和157
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159中任一项的核酸73
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330，SEQ ID NO:117
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122、152和156中任一项的核酸88
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345，或者SEQ ID NO:153的核酸79
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336存在至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
[0012]在一些方面，所编码的人Ins蛋白包含(i)信号肽(例如，野生型前胰岛素原信号序列、IL
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6信号序列或纤连蛋白信号序列)和(ii)SEQ ID NO:41的氨基酸25
‑
110、SEQ ID NO:144的氨基酸25
‑
110或SEQ ID NO:145的氨基酸25
‑
110。在一些方面，所编码的人胰岛素蛋白进一步包含切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)。
[0013]本公开的某些方面涉及包含编码人胰岛素(Ins)蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸包含开放阅读框(ORF)，该ORF包含：与SEQ ID NO:43
‑
57、110
‑
122或150
‑
159中任一项存在至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，该多核苷酸包含至少两个编码人Ins蛋白的核酸序列。在一些方面，该多核苷酸包含至少两个与SEQ ID NO:43
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57、110
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122或150
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码人胰岛素(Ins)蛋白的多核苷酸，其包含：(i)编码信号肽的核苷酸序列，任选地，其中所述信号肽不是野生型前胰岛素原信号序列，和(ii)编码胰岛素原多肽的核苷酸序列，所述胰岛素原多肽相对于野生型胰岛素原中相应的氨基酸位置包含在选自人胰岛素B链的氨基酸B10、B28和/或B29，人胰岛素C链的C1和/或C32，或者其任意组合的位置处的氨基酸修饰，并且任选地，所述多核苷酸进一步包括弗林蛋白酶切割位点。2.一种包含编码人胰岛素(Ins)蛋白的核酸的多核苷酸，其中所述核酸包含开放阅读框(ORF)，所述ORF包含：与以下任一项至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:43
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57、110
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116、150
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151、154
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155或157
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159中任一项的核酸73
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330，SEQ ID NO:117
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122、152或156中任一项的核酸88
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345，或者SEQ ID NO:153的核酸79
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336；或者(b)SEQ ID NO:43
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57、SEQ ID NO:110
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122或SEQ ID NO:150
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159。3.权利要求2所述的多核苷酸，其中编码的人Ins蛋白包含SEQ ID NO:41的氨基酸25
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110、SEQ ID NO:144的氨基酸25
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110、SEQ ID NO:145的氨基酸25
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110、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:145中任一项的氨基酸序列。4.权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述人Ins蛋白包含信号肽。5.权利要求1或4中任一项所述的多核苷酸，其中所述信号肽是野生型前胰岛素原信号序列、IL
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6信号序列或纤连蛋白信号序列。6.权利要求5所述的多核苷酸，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:41的氨基酸25
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110、SEQ ID NO:144的氨基酸25
‑
110或SEQ ID NO:145的氨基酸25
‑
110。7.权利要求1
‑
6中任一项所述的多核苷酸，其中所述人Ins蛋白进一步包含切割位点。8.权利要求1
‑
7中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸进一步包含5'UTR，所述5'UTR包含与SEQ ID NO:42的核酸5
‑
329至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列。9.权利要求1
‑
8中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸进一步包含5'UTR，所述5'UTR包含与SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:148至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列。10.权利要求1
‑
9中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸进一步包含3'UTR，所述3'UTR包含与SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、或SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:149至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列。11.权利要求1
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10中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'UTR进一步包含选自下组中的限制性位点：BamHI、EcoRI、NdeI、EcoRV、SpeI、XbaI、NheI、VspI、NsiI、ScaI、KpnI、SspI和PacI。12.权利要求1
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11中任一项所述的多核苷酸，其包含至少两个编码人Ins蛋白的开放阅读框(ORF)。13.权利要求12所述的多核苷酸，其中所述至少两个ORF通过IRES序列可操作地连接。14.权利要求13所述的多核苷酸，其中所述IRES序列包含与SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:143至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列。15.权利要求1
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10中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸包括：(a)与选自SEQ ID NO:1
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16中任一项的序列至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列或其任意组合。16.权利要求1
‑
11中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸包括：
(a)与选自SEQ ID NO:84
‑
88中任一项的序列至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列或其任意组合。17.权利要求12
‑
14中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸包括：(a)与选自SEQ ID NO:124
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126、130
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132和139
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141中任一项的序列至少85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列或其任意组合。18.权利要求1
‑
17中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸与启动子可操作地连接。19.一种表达盒，其包含权利要求1
‑
18中任一项所述的多核苷酸和与所述核酸序列可操作地连接的异源表达调控序列。20.权利要求19所述的表达盒，其中所述异源表达调控序列是启动子。21.权利要求20所述的多核苷酸或表达盒，其中所述启动子是真核生物启动子。22.权利要求21所述的多核苷酸或表达盒，其中所述启动子是CMV启动子。23.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或表达盒，其中将所述核酸可操作地连接到多腺苷酸化(多聚A)元件。24.一种载体，其包含前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或表达盒。25.权利要求24所述的载体，其中所述载体是病毒载体、非病毒载体、质粒、脂质或溶酶体。26.权利要求24所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。27.一种重组AAV(rAAV)颗粒，其包含：AAV衣壳和包含权利要求1
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23中任一项所述的多核苷酸或表达盒的载体基因组。28.权利要求26或27所述的载体或rAAV颗粒，其中所述AAV血清型选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVRH8、AAVrh9、AAV9、AAVrh10、AAV10、AAVRH10、AAV11、AAV12。29.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸、表达盒、载体或rAAV颗粒，其中所述信号肽是IL
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6信号肽或纤连蛋白信号肽。30.一种宿主细胞，其包含前述权利要求中任一项所述的多核苷酸、表达盒、载体或rAAV颗粒。31.权利要求30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。32.一种在细胞中产生人Ins蛋白的方法，其包括用权利要求1
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29中任一项所述的多核苷酸、表达盒、载体或rAAV颗粒接触和/或转化所述细胞，从而在所述细胞中产生所述人Ins蛋白。33.一种在受试者中产生人Ins蛋白的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1
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29中任一项所述的多核苷酸、表达盒、载体或rAAV颗粒，从而在所述受试者中产生所述人Ins...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：巴塞罗纳自治大学，
类型：发明
国别省市：