一株高滴度、多组织嗜性的鸡传染性支气管炎病毒毒株制造技术

本发明专利技术涉及病毒学技术领域，具体涉及一株高滴度、多组织嗜性的鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/GX/202109，其保藏编号为：CCTCC NO：V202257。该毒株经多次分离培养、纯化，经EID

【技术实现步骤摘要】
一株高滴度、多组织嗜性的鸡传染性支气管炎病毒毒株


[0001]本专利技术属于病毒学
，具体涉及一株高滴度、多组织嗜性的鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/GX/202109，还涉及该病毒的毒株特征。

技术介绍

[0002]传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）为单股正链RNA病毒，是冠状病毒科γ
‑
冠状病毒属的成员之一。IBV可以感染各年龄段鸡群，临床主要表现为上呼吸症状、肾炎和产蛋下降等，并可与其他病毒混合感染，给养禽业带来重大的损失。由于IBV基因组RNA复制的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对，以及临床免疫压力和自然选择等方面因素可造成IBV发生变异，病毒易发生变异及不同毒株基因组之间的同源重组，导致新的IBV基因型或突变株的不断出现。临床上不同的IBV毒株具有不同的组织嗜性和致病力，不同病毒株可以在腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、盲肠、肾脏、法氏囊和泄殖腔等不同器官组织中被发现，这可能与S蛋白有关。
[0003]IBV毒株可以从病料中分离得到，但是获得一株滴度高，同时致病力强，具有多组织嗜性，点眼、口服攻毒均发病的毒株实属不易；传统的IBV疫苗免疫方式主要采用注射或滴鼻免疫，筛选一株能通过喷雾或饮水方式均能致病的强毒株，可为今后制备鸡传染性支气管炎口服发病模型、口服疫苗的开发和制备提供候选毒株。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于通过多轮盲传和纯化提供一株滴度高，满足临床实际生产需求，同时可通过口服或点眼方式人工感染均能发病，致病力强，在多个组织中检测到该病毒，可作为候选口服疫苗攻毒、制备鸡传染性支气管炎口服发病模型的鸡传染性支气管炎病毒毒株。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：通过对广西某鸡场采食量下降，精神沉郁的28日龄黄羽肉鸡采集40份腺胃和肌胃样品进行IBV的分离、纯化和鉴定，得到一株高滴度、多组织嗜性的鸡传染性支气管炎病毒毒株，并命名为CK/CH/GX/202109，通过S1基因扩增、测序，该毒株属于“tl/CH/LDT3/03”型IBV毒株。
[0006]鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/GX/202109已于2022年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202257，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
[0007]本专利技术将鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/GX/202109纯培养物通过口服或点眼途径人工感染1日龄SPF鸡只，开展致病力试验。结果如下：该病毒纯培养物对1日龄的鸡只具有很强的致病力，表现为1日龄SPF鸡只在感染后出现呼吸道症状，第6 d开始出现死亡，感染后14 d口服组总死亡率为30%，点眼组总死亡率为40%，剖检观察肾炎、腺胃肌胃连接处肿大、腺胃乳头消失、肌胃鸡内金脱落和法氏囊萎缩，免疫组化显示在肾脏、腺胃、肌胃、空肠、回肠和直肠检测到病毒，表现为多组织嗜性。致病力试验结果表明该病毒纯培养物通过口
服或点眼途径感染1日龄都能致病。IBV的疫苗毒株每羽份病毒含量应≥10
3.5
EID
50
，每瓶2000羽份病毒含量应≥10
7.2
EID
50
，本专利技术毒株具备致病性强，滴度高的特性，EID
50
为10
‑
7.85
/mL，已达到疫苗制备的培养滴度，同时该毒株具有广泛的组织嗜性，因此，该毒株具备开发成可通过饮水或喷雾进行免疫的疫苗毒株及制备鸡传染性支气管炎口服发病模型的潜力。
[0008]本专利技术的优点在于：本专利技术经分离及纯化、鉴定，获得一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，其分类命名为鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/GX/202109，该毒株于2022年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202257，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该毒株滴度高，采用口服和点眼感染可导致SPF鸡只出现死亡，并在多个组织检测到该病毒。本专利技术的毒株滴度高，口服和点眼感染该毒株均对1日龄鸡只有致病力，更适合将该毒株开发成临床IBV感染预防的口服疫苗毒株。
[0009]附图说明：图1：1日龄SPF鸡攻毒组的临床剖检情况。A：鸡只精神沉郁（第7 d）；B：气囊炎（第7 d）；C：腺胃以及腺胃肌胃连接处肿大（第14 d）；D：腺胃乳头消失（第14 d）；E：肌胃鸡内金脱落（第7 d）；F：肾脏肿大，尿酸盐结晶（第7 d）。
[0010]图2：1日龄SPF鸡攻毒组的免疫组化结果。A：腺胃（第14 d）；B：肌胃（第7 d）；C：空肠（第7 d）；D：回肠（第7 d）；E：直肠（第7 d）；F：肾脏（第14 d）。
具体实施方式
[0011]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0012]实施例1毒株的分离及纯化、鉴定一株鸡传染性支气管炎病毒毒株的分离及纯化、鉴定，包括以下步骤：1）病料处理：2020年3月
‑
5月，广西某大型鸡场有多个三黄肉鸡群临床表现为精神沉郁，采食量下降、生长缓慢，剖检可见腺胃炎，鸡群已免疫H120和4/91疫苗，并且出现多日龄鸡群发病，小日龄鸡群死亡，怀疑可能是传染性支气管炎病毒感染。将腺胃或肌胃病料分开，每5个腺胃混合作为1份样品，每5个肌胃作为1个样品，总共20份样品，按常规方法进行组织匀浆，冻融1次，12000 rpm离心10 min后，取上清液用 0.45μm滤器除菌后，取140 μL上清液经RT
‑
PCR验证为IBV为阳性再进行鸡胚接种，结果表明有10份样品为IBV阳性。IBV检测引物序列参考国家标准《鸡传染性支气管炎诊断技术》GB/T 23197
‑
2008，引物序列为：5
’‑
GGAAGATAGGCATGTAGCTT
‑3’
(F)；5
’‑
CTAACTCTATACTAGCCTAT
‑3’
(R)。
[0013]2）病毒分离：取样品上清液0.2 mL接种10日龄SPF鸡胚，共接种10枚鸡胚，继续孵化7天，观察鸡胚病变，弃掉24 h以内死亡鸡胚，分别在第4 d，5 d，6 d和7 d各收取2枚鸡胚尿囊液混合后记为第1代，当天收取后，再取第1代尿囊液0.2 mL接种10日龄SPF鸡胚，连续传代4次，只有3份样品盲传鸡胚孵化到第17日龄后，可观察到个别鸡胚个体发育较小、头和爪合抱一起、胚体蜷缩的典型“侏儒胚”现象，经RT
‑
PCR鉴定为IBV阳性。
[0014]3）病毒纯化：第3代尿囊液采用有限稀释法稀释到10
‑8，从10
‑4到10
‑8每个稀释度各
接种5枚接胚，弃掉24 h以内死亡鸡胚，接种后继续孵化5 d收集稀释度高、病变明显的单个尿囊液样品，连续稀释5次，其中1份样品第2次有限稀释法稀释度为10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高滴度、多组织嗜性的鸡传染性支气管炎病毒毒株，其特征在于：所述毒株分类命名为鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/GX/202109，已于2022年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202257，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒毒株，其特征在于：所述鸡传染性支气管炎病毒毒株的纯培养物在SPF鸡胚中培养的滴度EID
50
为10
‑
7.85
/mL。3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒毒株，其特征在于：所述鸡传染性支...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晨燕，侯博，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：