去人源的组织前处理方法技术

本发明专利技术公开了一种去人源的组织前处理方法，包括步骤：对组织样本进行微离心后，保留沉淀和上清；向沉淀中加入蛋白酶K，36.5℃～37.5℃消化；消化后，高速离心，去上清；加入保留的上清，即可。本发明专利技术的去人源的组织前处理方法，通过对组织样本进行微离心后，保留上清，同时控制蛋白酶K的消化温度和时间，以及消化后高速离心去除上清，最后在沉淀中回补保留的上清，在各个步骤的密切配合下，最终提高了病原菌的检出能力，尤其是对真菌、胞内菌、细菌、病毒等病原微生物的检出性能更高。毒等病原微生物的检出性能更高。

【技术实现步骤摘要】
去人源的组织前处理方法


[0001]本专利技术属于成分分析
，更具体地，本专利技术涉及一种去人源的组织前处理方法。

技术介绍

[0002]宏基因组测序(mNGS)逐步被应用于感染性疾病的临床检测，虽然广获好评与认可，但不同的标本类型需要根据其特性，进行不同的前处理来保障对病原的检出。如血浆样本中含有人源背景细胞中位数约2.3x105，且含有大量的游离核酸，脑脊液样本含有人源背景细胞中位数约3x104，且核酸浓度低，均不适合去人源操作。肺泡灌洗液样本中含有人源背景细胞中位数1x105，因来源于患者感染部位，通过去人源方案可有效去除人源细胞，提高病原检出。
[0003]组织样本以块状形态构成，含有的人源背景细胞中位数为1x107～1x108之间，其人源核酸占比远远高于支气管肺泡灌洗液、血浆等标本类型。虽然，目前使用去人源技术能够有效提高病原微生物的检出能力，但组织样本的前处理方式不同，其病原的检出能力差异较大。
[0004]现有的组织样本的前处理方法通常包括以下几种：
[0005]1、取大米粒大小的新鲜组织块于破壁管中，组织块尽量切细碎，加入500PBS缓冲液，在破壁仪上以最大速度破碎1min。组织充分匀浆，准备去人源；该方法高速破壁容易导致病原细胞破裂，且由于未作蛋白酶消化，不能使细胞完全游离，不利于去人源操作。
[0006]2、取1.5mL的离心管并做好标记，分别加入20uL蛋白酶K溶液到管底，720uLPBS缓冲液，剪取少量组织(不超过25mg)，在离心管剪碎后，56℃，振荡30min，直至完成裂解，完成后微离心，准备去人源；该方法中使用剪刀剪碎组织，不能充分破碎组织，且将蛋白酶K溶液在56℃振荡反应，可能导致部分病原死亡使核酸释放，不利于去人源操作。
[0007]3、剪取约20mg组织块样品，转移至1.5mL的DNase/RNase
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free离心管中(注：为保证提取效果，勿使用过量组织)。加入150μL裂解液LB、450μL灭菌水和20μL蛋白酶K溶液，用剪刀剪碎混匀或用电动匀浆器匀浆，置56℃水浴中消化10
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30min，瞬时离心取上清；该方法中将蛋白酶K溶液在56℃振荡反应，可能导致部分病原死亡使核酸释放，不利于去人源操作。
[0008]4、取整块组织至含有100uL样本液体或ddH2O的EP管中，用剪刀或者研磨棒剪碎，加入适量(200uL
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1000uL)样本液体或ddH2O，震荡混匀静止10min后(取部分用于实验，其余分装保存)，进入去人源步骤。该方法未经过蛋白酶处理，不能使组织充分裂解导致去人源流程效果较差。
[0009]因此，非常有必要提供一种可以提高病原微生物检出能力的去人源的组织前处理方法。

技术实现思路

[0010]基于此，本专利技术的目的在于提供一种去人源的组织前处理方法，所述前处理方法可以提高病原微生物的检出能力。
[0011]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0012]一种去人源的组织前处理方法，包括以下步骤：
[0013](1)、对组织样本进行微离心后，保留上清待用；
[0014](2)、向沉淀中加入蛋白酶K，36.5℃～37.5℃消化；
[0015](3)、消化后，高速离心，去上清；
[0016](4)、加入步骤(1)中保留的上清，即可。
[0017]本专利技术的去人源的组织前处理方法，通过对组织样本进行微离心后，保留上清，同时控制蛋白酶K的消化温度和时间，以及消化后高速离心去除含有蛋白酶K的上清，最后在沉淀中回补保留的上清，在各个步骤的密切配合下，最终提高了病原菌的检出能力，尤其是对真菌、胞内菌、细菌、病毒等病原微生物的检出性能更高。
具体实施方式
[0018]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0020]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0021]本专利技术的其中一些实施例中，提供了一种去人源的组织前处理方法，包括以下步骤：
[0022](1)、将待处理样本的组织至含有待处理样本液体(部分样本送检前可能会用生理盐水浸泡保存)或ddH2O的EP管中，使用研磨棒进行研磨；
[0023]该步骤中，使用研磨棒进行研磨可以有效保证组织充分裂解，也能防止因震荡速率过高导致细菌或真菌细胞破裂，释放出核酸，在DNaseI过程中被消化；
[0024]在其中一些实施例中，所述组织为整块组织，充分研磨整块组织可避免感染部位的差异影响病原检出。
[0025](2)、研磨后加入适量待处理样本液体或ddH2O，震荡混匀，分装(每一份组织块沉淀大小不超过绿豆)；
[0026]在该步骤中，研磨后加入适量待处理样本液体或ddH2O，有助于组织上的病原脱离并均匀分散，保证预留的组织样本与实验组织样本基本一致，有效保证实验的可重复性；
[0027](3)、对分装样本进行微离心，保留上清待用；
[0028]在该步骤中，通过低速离心，使微小细菌颗粒保留在上清中，保留上清可防止病原的丢失，且由于上清中可能存在病毒，上清未经过蛋白酶K处理，其蛋白外壳不会被蛋白酶K消化，不会释放出核酸被DNaseI酶消化，从而有效保护了病毒；
[0029]在其中一些实施例中，所述微离心的离心速度为3000rcf～4000rcf，离心时间为10s～15s。
[0030](4)、向沉淀管中加入ddH2O，再加入蛋白酶K(使蛋白酶K的工作浓度为1.5mg/ml～2.5mg/ml)，保持36.5℃～37.5℃消化25min～35min；
[0031]在其中一些实施例中，所述消化温度为36.8℃～37.2℃，所述消化时间为28min～32min。
[0032]在其中一些实施例中，所述消化温度为36.9℃～37.1℃。
[0033]该步骤中，采用36.5℃～37.5℃进行消化，不仅能够达到组织消化完全的效果，且36.5℃～37.5℃接近身体体温，在消化组织的过程中，对于病原细胞无明显影响，可有效降低高温对病原细胞的损害；
[0034](5)、消化后高速离心，去上清；
[0035]在其中一些实施例中，所述离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去人源的组织前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、对组织样本进行微离心后，保留沉淀和上清；(2)、向沉淀中加入蛋白酶K，36.5℃～37.5℃消化；(3)、消化后，高速离心，去上清；(4)、加入步骤(1)中保留的上清，即可。2.根据权利要求1所述的去人源的组织前处理方法，其特征在于，步骤(2)中所述消化温度为36.8℃～37.2℃。3.根据权利要求2所述的去人源的组织前处理方法，其特征在于，所述消化温度为36.9℃～37.1℃。4.根据权利要求1所述的去人源的组织前处理方法，其特征在于，步骤(2)中所述消化时间为28min～32min。5.根据权利要求1所述的去人源的组织前处理方法，其特征在于，步骤(2)中所述蛋白酶K的工作浓度为1.5mg/ml～2.5mg/ml。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：余艳，葛虎，唐春燕，许寻寻，谭兵健，苏洁琼，何媛，裴丽琼，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：