一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗和应用制造技术

本发明专利技术涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗和应用。所述布鲁氏菌为自然分离的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒菌株，命名为RM101，其保藏编号为：CGMCC No.25728。由本发明专利技术粗糙型羊种布鲁氏菌RM101株制成的布鲁氏病活疫苗具有良好的安全性、免疫原性和效力，可用于孕畜免疫，不会导致流产，弥补了现有疫苗不能用于孕畜的缺陷。本发明专利技术的疫苗可通过微量凝集试验实现鉴别诊断，解决现有布病疫苗无法实现临床区分疫苗免疫和野菌感染的鉴别诊断的技术问题。感染的鉴别诊断的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗和应用


[0001]本专利技术涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗和应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病又称波状热、地中海热或马耳他热，是一种人兽共患传染病。所有人均可被感染，无年龄、性别差异，通过直接或间接接触被感染动物或其制品进行传播。人类感染布鲁氏菌病后，病程长，反复发作，长期不愈，严重者丧失劳动力；家畜感染则出现流产和不育，对畜牧业生产和人类健康造成非常严重的危害。
[0003]布鲁氏菌有多个生物种，羊种、牛种、猪种、犬种、绵羊附睾种、沙林鼠种等，按感染人强弱排序分别为羊种、牛种和猪种。
[0004]世界布鲁氏菌病防控实践反复证实，控制好动物布鲁氏菌病是防控人间布鲁氏菌病最经济最有效的策略，在布鲁氏菌病流行严重的情况下，疫苗免疫是有效控制的唯一选择。从20世纪初期至今，科研人员一直没有放弃开发合适的疫苗用于防控布鲁氏菌病，但至今没有获得比较理想的布鲁氏菌病疫苗。
[0005]安全性不高一直是当前布鲁氏菌病疫苗的痛点。目前我国使用的布鲁氏菌病疫苗主要有羊种M5株、猪种S2株、牛种A19株，国际上主要有羊种Rev.1、牛种S19和牛种RB51株，以上布鲁氏菌病疫苗无一能够通过注射方法免疫怀孕动物，且对人具有不同程度的感染风险。由于动物怀孕状况牧民难以掌握，限制了布鲁氏菌病疫苗的广泛应用。唯有解决注射免疫怀孕动物的问题，才能确保我国布鲁氏菌病疫苗的推广使用和免疫密度，达到免疫保护效果。
[0006]另外，布鲁氏菌病无法实施鉴别诊断是限制布鲁氏菌病疫苗广泛应用的另一个重要因素。国际上有多篇公开文献报道布鲁氏菌基因缺失苗，缺失的基因通常为非主要抗原基因，其在血清中产生的抗体量非常小，甚至不能产生可检测到的抗体，难以实现临床鉴别诊断。现有的疫苗均为光滑型布鲁氏菌株，感染的野菌均为光滑型布鲁氏菌，故因此开发安全、高效、可鉴别的布鲁氏菌病毒株已成为迫在眉睫的一项战略性课题。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株。
[0008]所述粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株命名为RM101，已于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.25728。
[0009]本专利技术还提供了所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株在制备防治布鲁氏菌所致疾病的药物中的用途。
[0010]本专利技术还提供了所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株在制备布鲁氏菌病疫苗中的用途。
[0011]本专利技术还提供了所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株在制备鉴别诊断布鲁氏菌所致疾病的试剂中的应用。
[0012]本专利技术还提供了一种由所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株制成的活疫苗。
[0013]本专利技术还提供了一种由所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株制成的冻干活疫苗，其特征在于，由所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株和冻干保护剂以1:1～7:1的配比冻干制成。
[0014]进一步，所述冻干保护剂由明胶和蔗糖按照1:2～1:5的配比制成。
[0015]本专利技术还提供了含有所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株的灭活凝集抗原。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0017]本专利技术提供的布鲁氏菌株，是从羊的淋巴结中分离得到，为自然分离弱毒菌株。本专利技术布鲁氏菌株用Bruce
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ladder方法鉴定为羊种，菌落结晶紫染色确定为粗糙型，全基因组大小为3.36Mb，是一种可用于疫苗制备的弱毒菌株，为粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株，经过试验发现本专利技术布鲁氏菌株毒力弱于现有的布鲁氏菌弱毒株，具备很好的安全性和有效性。
[0018]由本专利技术布鲁氏菌株制备的布鲁氏菌病活疫苗可预防牛羊布鲁氏菌病，可用于孕畜注射免疫，解决了现有布病疫苗均不能用于怀孕动物，对怀孕动物不安全的重大缺陷。
[0019]本专利技术提供的布鲁氏菌株制备的布鲁氏菌病活疫苗能实现临床鉴别诊断，解决现有疫苗不能实现临床鉴别诊断，从而不能准确科学防控的世界性科学难题。使用该疫苗免疫动物后产生的血清与野生布鲁氏菌感染产生的血清可用微量凝集实验进行鉴别，实现临床鉴别诊断。
附图说明
[0020]图1为Bruce
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ladder PCR电泳图，其中，M:Marker 2000；1:羊种布鲁氏菌M111对照；2:分离株B.melitensis 101；3:阴性对照；
[0021]图2为菌落结晶紫染色结果，其中，A.猪种S2株(光滑型)；B.羊种RM101株(粗糙型)；
[0022]图3为RM101的基因组圈图，其中，A.染色体I的基因组圈图；B.染色体II的基因组圈图。最外圈为基因组大小的标示，每个刻度为5kb；第二圈和第三圈分别为基因组正链和负链上的gene，不同颜色代表不同的COG功能分类；第四圈为重复序列；第五圈为tRNA和rRNA，蓝色为tRNA，紫色是rRNA；第六圈为GC含量，浅黄色部分表示该区域GC含量高于基因组的平均GC含量，峰值越高则与平均GC含量差异越大，蓝色部分则表示该区域GC含量低于基因组的平均GC含量；最内圈是GC
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skew，深灰色代表G含量大于C的区域，红色代表C含量大于G的区域；
[0023]图4为鉴别诊断微量凝集试验结果图，其中，T2为T1的示意图，T1中的A、B、C、D行每孔加的凝集抗原为粗糙型凝集抗原，对应的1、2、3、4列凝集抗原的最终稀释度为1:50、1:100、1:200和1:400；E、F、G、H四行每孔加的凝集抗原为光滑型抗原，对应的1、2、3、4列凝集抗原的最终稀释度为1:50、1:100、1:200和1:400；加样时，A、B、C、D、E、F、G、H分别为粗糙型阳性血清、粗糙型阴性血清、光滑型阳性血清、光滑型阴性血清、粗糙型阳性血清、粗糙型阴性血清、光滑型阳性血清和光滑型阴性血清。
[0024]图5为革兰氏与柯氏染色结果图，其中，A.柯氏染色图；B.革兰氏染色图；
[0025]图6为Nanopore建库流程图。
[0026]图7为冻干后外观性状
具体实施方式
[0027]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围；实施例所用试剂，如无说明，均可从商业途径购买；所用布鲁氏菌病活疫苗S2株、A19株为重庆澳龙生物制品有限公司产品；M5为天康生物制药有限公司产品；所用布鲁氏菌M111株和M28株为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存。
[0028]实施例1粗糙型羊种布鲁氏菌RM101株的分离与鉴定
[0029]本实施例是经一系列分离和鉴定研究，验证RM101株的生物与生化特性。RM101株经从淋巴结中分离出来后，革兰氏、柯氏染色以及血清学特异性试验、结晶紫染色、Bruce
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ladder PCR、小鼠、豚鼠毒力测定等试验鉴定，结果表明RM101为一株粗糙型羊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.25728。2.权利要求1所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株在制备防治布鲁氏菌所致疾病的药物中的用途。3.权利要求1所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株在制备布鲁氏菌病疫苗中的用途。4.权利要求1所述的粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株在制备鉴别诊断布鲁氏菌所致疾病的试剂中的应用。5.一种由权利要求1所述的粗糙...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙石静，赵亚荣，丁家波，蒋卉，宋程，李筱英，汤波，闫国晖，刘奇，聂思静，张学贤，王敏，陈硕，马阿丽，何杰，
申请(专利权)人：兆丰华生物科技南京有限公司兆丰华生物科技南京有限公司北京生物医药科技中心，
类型：发明
国别省市：