分析多种荧光团的混合荧光响应的方法和荧光分析仪技术

提供了一种分析显微样品中多种荧光团的混合荧光响应的方法、荧光分析仪、荧光显微镜和计算机程序。该方法包括光谱解混和用于确定和验证其参考发射光谱的过程。该过程包括以下步骤：(a)为样品的图像的序列提供多个图像采集设置，图像等于或大于多种荧光团并且包括用于图像序列中的每一个的照明设置，(b)使用多个图像采集设置采集样品的图像序列，并将样品的图像序列中的每一个与对应的照明设置一起存储，(c)使用一个或多个参考发射光谱确定算法来确定待从样品的图像序列重构的荧光团的候选参考发射光谱，以及(d)有条件地使用所述候选参考发射光谱作为所述光谱解混中的参考发射光谱。发射光谱。发射光谱。

【技术实现步骤摘要】
分析多种荧光团的混合荧光响应的方法和荧光分析仪


[0001]本专利技术涉及一种分析显微样品中多种荧光团的混合荧光响应的方法，以及一种荧光分析仪、一种荧光显微镜和一种计算机程序。

技术介绍

[0002]WO 2021/185557 A1公开了一种用于对包括具有不同光谱发射特性的不同荧光团的物体进行成像的荧光显微镜。荧光显微镜包括光学系统，该光学系统被配置成收集从视场内的不同荧光团发射的荧光，以聚焦荧光用于检测。提供了一种光谱分光布置，该光谱分光布置被配置成将视场内收集的荧光分成至少两个光谱不同的荧光分量。包括至少两个图像传感器的多通道检测器系统被配置成基于至少两个光谱不同的荧光分量来检测至少两个空间光强度分布，其中每个空间光强度分布表示视场上的物体的图像。该荧光显微镜还包括处理器，该处理器被配置成基于每个空间光强度分布的光谱解混分析来确定不同荧光团种类的空间分布。
[0003]本专利技术的目的是改善在与所讨论的系统类似的系统中，但也在任何其他荧光显微镜和其中分析多种荧光团的荧光响应的类似设备中进行的光谱解混过程，特别是在有效性和用户友好性方面进行改善。

技术实现思路

[0004]提供了一种分析显微样品中多种荧光团的混合荧光响应的方法，其中混合荧光响应包括多种荧光团中的每一种的单独荧光响应的贡献，其中该方法包括使用光谱解混基于待重构的荧光团的参考发射光谱或端元光谱(endmember spectra)从混合荧光响应重构所述单独荧光响应。
[0005]所述方法包括用于确定和验证参考发射光谱的过程，所述过程包括(a)为样品的图像序列提供多个图像采集设置，图像等于或大于多种荧光团并且包括用于图像序列中的每一个的照明设置，(b)使用多个图像采集设置采集样品的图像序列，并且将样品的图像序列中的每一个与对应的照明设置一起存储，(c)使用一个或多个参考发射光谱确定算法从样品的图像序列确定待重构的荧光团的候选参考发射光谱，以及(d)有条件地使用所述候选参考发射光谱作为所述光谱解混中的参考发射光谱。
[0006]根据本专利技术的实施例提出的方法能够可靠地确定用于荧光图像的光谱解混的参考发射光谱。这是在最少的用户干预下通过自动采集必要的图像、执行光谱确定、任选地检查光谱确定的真实性以及任选地向用户给出关于光谱确定结果的反馈来实现的。该方法可以直接在之后待成像的样品上执行，从而不需要附加的参考样品。
[0007]在本专利技术的实施例中，该方法还包括另外的步骤(i)在上文所指示的步骤(c)与(d)之间对候选参考发射光谱执行真实性检查(plausibility check)，真实性检查的结果指示候选参考发射光谱对于待重构的荧光团是否可信；以及另外的步骤(ii)如果真实性检查的结果是肯定的，则使用所述候选参考发射光谱作为根据上文所指示的步骤(d)的所述
光谱解混中的参考发射光谱，或者如果真实性检查是否定的，则拒绝所述候选参考发射光谱。在本专利技术的实施例中，所述真实性检查确保仅有效的参考发射光谱被进一步使用；即，如果发现候选参考发射光谱无效，则可以将其丢弃，并且例如可以替代地使用默认或先前的参考端元光谱。
[0008]在本专利技术的实施例中，照明设置可以是线性独立的。如果照明设置被表示为每列有一个照明设置并且每行有相应强度的矩阵，则预期存在线性独立性。这是当使用单独启用的光源时对角矩阵的情况，但也可以是当若干个光源被启用时的情况。因此，本专利技术的实施例可以通用地和灵活地适用于这些不同的情况。
[0009]根据本专利技术的实施例，用于图像序列中的每一个的照明设置可以包括在多个光源中选择单个光源，该单个光源包括发光二极管、给定中心波长的激光器或者波长选择设备，该波长选择设备可以特别地被配置成从宽带光源中选择(连续的)照明光谱，该宽带光源例如选自经典的滤波器、声光滤波器或选择设备以及光谱仪。因此，本专利技术的实施例可用于大量不同类型的荧光显微镜技术。
[0010]通常，根据本专利技术的实施例，用于确定和验证参考发射光谱的过程可以在至少两个时间实例中执行，至少两个时间实例包括先前实例和后续实例。这允许在该过程的后续实例中(重新)使用先前得到的结果。
[0011]根据本专利技术的实施例，在后续实例中执行真实性检查可以包括基于在先前实例中采集的参考发射光谱执行评估。根据本专利技术的实施例，当在先前实例中执行真实性检查的所述结果是肯定的时，所述候选参考发射光谱可以被存储以在所述后续实例中的所述真实性检查中使用。特别地，在这样的实施例中，从一个实例到另一个实例的逐渐改善变得可能。
[0012]根据本专利技术的实施例，如果当在先前实例中真实性检查是肯定的时，在后续实例中使用的设置是基于在先前实例中使用的照明设置，则这种结果的逐渐改善或者结果的有利(重新)使用特别变得可能。
[0013]根据本专利技术的实施例，图像采集设置可以包括基于样品性质选择的检测器或相机设置，样品性质包括样品的活动性或敏感性中的至少一个，并且检测器或相机设置包括合并(binning)因子、扫描速度、扫描分辨率、增益值和曝光时间中的至少一个。也就是说，在这样的实施例中，设置可以具体地适于或多或少活动的或敏感的样品，从而改善结果，同时特别地保护敏感的样品。
[0014]在本专利技术的实施例中，可以使用荧光显微镜来确定混合荧光响应，其中该荧光显微镜是被配置成在选自宽场模式、共焦模式和光片模式的至少一种显微镜模式下操作的荧光显微镜，并且其中用于确定和验证参考发射光谱的过程针对所述显微镜模式中的至少一种模式来执行。因此，本专利技术的实施例允许灵活地操作单个仪器的多种模式。
[0015]根据本专利技术的实施例，用于确定和验证参考发射光谱的过程可以作为对校准请求的响应来执行，其中校准请求可以是由用户发出的校准请求、基于图像分析步骤的结果发出的校准请求、基于预定义时间点发出的校准请求和当确定视场变化时发出的校准请求中的至少一个。也就是说，本专利技术的实施例允许定期(重新)校准或基于需求的(重新)校准，并因此得到改善的分析结果。
[0016]特别地，并且在本专利技术的实施例中，当图像分析指示预定强度范围内的相邻像素
的数量和/或对应于在解混图像之间计算的相关系数的值高于预定阈值时，可以发出所述校准请求。因此，可以使用可靠并自动的确定来确定何时需要(重新)校准。
[0017]在本专利技术的实施例中，可以向用户发出用户反馈和/或可以向用户提供使用默认参考发射光谱的可能性。这允许通常有知识的用户的专业知识的参与。
[0018]在本专利技术的实施例中，所述一个或多个参考发射光谱确定算法可以包括N
‑
FINDR算法、像素纯度指数、非负矩阵或张量因子分解、顶点或主成分分析、经训练的神经网络和优化算法中的至少一个。这些算法可以单独使用或者组合使用，并且对于得到可靠的结果特别有利。
[0019]根据本专利技术的实施例，参考激发光谱可以被提供并在确定候选参考发射光谱中被使用。
[0020]在本专利技术的实施例中，候选参考发射光谱的真实性检查可以包括确定与给定参考发射光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析显微样品(200)中多种荧光团(230)的混合荧光响应的方法(10)，其中所述混合荧光响应包括多种荧光团(230)中的每一种的单独荧光响应的贡献，其中所述方法(10)包括使用光谱解混基于待重构的所述荧光团的参考发射光谱从所述混合荧光响应重构所述单独荧光响应，并且其中所述方法(10)包括用于确定和验证所述参考发射光谱的过程，所述过程包括以下步骤：a)为所述样品(200)的图像序列提供(2)多个图像采集设置，所述图像等于或大于所述多种荧光团(230)并且包括用于所述图像序列中的每一个的照明设置，b)使用所述多个图像采集设置采集(3)所述样品(200)的所述图像序列，并将所述样品(200)的所述图像序列中的每一个与对应的照明设置一起存储，c)使用一个或多个参考发射光谱确定算法从所述样品(200)的所述图像序列确定(4)待重构的所述荧光团的候选参考发射光谱，以及d)有条件地使用(6)所述候选参考发射光谱作为所述光谱解混中的所述参考发射光谱。2.根据权利要求1所述的方法(10)，包括另外的步骤：i)在步骤c)与d)之间执行(5)所述候选参考发射光谱的真实性检查，所述真实性检查的结果指示所述候选参考发射光谱对于待重构的所述荧光团是否可信，以及ii)如果所述真实性检查的结果是肯定的，则使用(6)所述候选参考发射光谱作为根据步骤d)的所述光谱解混中的所述参考发射光谱，或者如果所述真实性检查是否定的，则拒绝所述候选参考发射光谱。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法(10)，其中，所述照明设置是线性独立的，和/或其中，所述图像序列中的每一个的照明设置包括在多个光源中选择单个光源，所述单个光源包括发光二极管、给定中心波长的激光器或波长选择设备。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(10)，其中，用于确定和验证所述参考发射光谱的所述过程在至少两个时间实例中执行，所述至少两个时间实例包括先前实例和后续实例。5.根据当从属于权利要求2时的权利要求4所述的方法(10)，其中，在所述后续实例中执行(5)所述真实性检查包括基于在所述先前实例中采集的参考发射光谱来执行评估，和/或其中，当在所述先前实例中执行(5)所述真实性检查的所述结果是肯定的时，存储所述候选参考发射光谱以在所述后续实例中的所述真实性检查中使用，和/或其中当在所述先前实例中所述真实性检查为肯定的时，在所述后续实例中使用的所述照明设置是基于在所述先前实例中使用的所述照明设置。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法(10)，其中，所述图像采集设置包括基于样品性质选择的检测器或相机设置，所述样品性质包括所述样品的活动性或敏感性中的至少一个，并且所述检测器或相机设置包括合并因子、扫描速度、扫描分辨率、增益值和曝光时间中的至少一个。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法(10)，其中，使用荧光显微镜(100)来确定所述混合荧光响应，其中所述荧光显微镜(100)是被配置成在选自宽场模式、共焦模式和光片模式的至少一种显微镜模式下操作的荧光显微镜(100)，其中针对所述显微镜模式中的至少一种模式执行用于确定和验证所述参考发射光谱的所述过程。
8.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：本杰明，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：