用于校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测结果的基因片段、内参菌和校正方法技术

本申请涉及生物技术领域，具体涉及用于校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测结果的基因片段、内参菌和校正方法。该基因片段包括正向引物序列、绿色荧光蛋白基因截短序列、第一卡那霉素抗性基因截短序列、第二卡那霉素抗性基因截短序列、反向引物序列；正向引物序列和/或反向引物序列对应于尖孢镰刀菌萎蔫专化型检测引物序列。通过对4份不同地区不同质地的土壤样品中尖孢镰刀菌萎蔫专化型及内参菌株IC

【技术实现步骤摘要】
用于校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测结果的基因片段、内参菌和校正方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及用于校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测结果的基因片段、内参菌和校正方法。

技术介绍

[0002]棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)引起的棉花系统性土传病害，在世界各地普遍发生，对棉花的品质和产量造成严重的损失。由于土传病害受气候等外界环境因子的影响相对较小，土壤中病原菌数量往往是病害流行的主要决定因素。因此，定量检测土壤中病原菌数量对此类病害预测预报及有效防治具有重要意义。
[0003]尖孢镰刀菌的检测已有很多方法，如平板检测法、生物测定法、血清学检测法、常规PCR检测和定量PCR(qPCR)检测技术等。qPCR技术因其检测快速、灵敏度高、特异性强、可定量等特点成为近些年最重要的检测技术。我国不同地区土壤的土壤类型、有机质含量和pH值差异很大，同时土壤中富含酚类、多糖、腐植酸、重金属离子等PCR抑制因子，这些因素均会影响土壤中尖孢镰刀菌萎蔫专化型DNA的提取和后续的qPCR检测。
[0004]但是目前已报道的土壤尖孢镰刀菌萎蔫专化型qPCR定量检测方法均未对包括样品预处理、DNA提取纯化以及qPCR检测在内的整个样品检测过程进行有效的校正。
[0005]因此，建立合适的内参用于校正检测结果，消除各种因素造成的病原菌回收效率偏差，对于土壤尖孢镰刀菌萎蔫专化型的准确检测十分重要。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了用于校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测结果的基因片段、内参菌和校正方法。该基因片段或内参菌可有效校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测准确度。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种基因片段，该基因片段包括正向引物序列、绿色荧光蛋白基因截短序列、第一卡那霉素抗性基因截短序列、第二卡那霉素抗性基因截短序列、反向引物序列；
[0009]正向引物序列和/或反向引物序列对应于尖孢镰刀菌萎蔫专化型检测引物序列。这里所述的“正向引物序列”是指在DNA链的5
’
端、与正向引物序列相同的一段DNA序列。这里所述的“反向引物序列”是指在DNA链的3
’
端、与反向引物序列互补的一段DNA序列。
[0010]在本专利技术中，截短序列的选择，一方面需要保证序列长度不要过长，降低合成成本，另一方面需要保证该序列在自然界中不存在。
[0011]优选地，为保证内参片段和目的片段(尖孢镰刀菌萎蔫专化型检测片段)有一致的扩增效率，内参片段序列长度与目的片段序列长度保持一致。
[0012]作为优选，绿色荧光蛋白基因为其截短序列，其截短序列如SEQ ID NO：6所示。
[0013]作为优选，第一卡那霉素抗性基因截短序列如SEQ ID NO：7所示。
[0014]作为优选，第二卡那霉素抗性基因截短序列如SEQ ID NO：8所示。
[0015]在本专利技术中，本专利技术基因片段需要与尖孢镰刀菌萎蔫专化型具有一致的扩增引物，以保证扩增效率的一致。
[0016]作为优选，正向引物序列如SEQ ID NO：1所示。
[0017]作为优选，反向引物序列如SEQ ID NO：9所示。
[0018]作为优选，第一卡那霉素抗性基因截短序列与第二卡那霉素抗性基因截短序列之间还包括连接序列。
[0019]作为优选，连接序列包括SpeI酶切位点序列，但本专利技术的连接序列并非限定于此，只要本领域技术人员认可的连接序列均在本专利技术保护范围之内。
[0020]在本专利技术提供的具体实施例中，SpeI酶切位点序列为ACTAGT。
[0021]在本专利技术提供的具体实施例中，本专利技术基因片段的序列如SEQ ID NO：5所示。
[0022]本专利技术还提供了一种生物材料，该生物材料包括上述基因片段。
[0023]作为优选，生物材料包括重组载体和/或重组细胞；
[0024]作为优选，所述内参菌的出发菌株为尖孢镰刀菌向日葵专化型。
[0025]本专利技术还提供了一种内参菌，内参菌包括上述基因片段，和/或，包括上述生物材料。
[0026]作为优选，内参菌的出发菌株为尖孢镰刀菌萎蔫专化型。
[0027]作为优选，内参菌为将尖孢镰刀菌萎蔫专化型中的SEQ ID NO：4所示的基因片段替换为本专利技术的基因片段之后得到的菌株。
[0028]作为优选，基因片段替换所用的方法为基因同源重组技术。
[0029]本专利技术还提供了一种上述内参菌的定量分析试剂，该定量分析试剂包括如下引物和探针：
[0030]如SEQ ID NO：1所示的正向引物；
[0031]如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
[0032]如SEQ ID NO：10所示的探针。
[0033]在本专利技术的具体实施例中，探针的5
’
端标记有荧光基团，3
’
端标记有淬灭基团。
[0034]在本专利技术的具体实施例中，荧光基团选自FAM、VIC、HEX、CY5中的任一种。
[0035]在本专利技术的一具体实施例中，荧光基团为FAM。
[0036]在本专利技术的具体实施例中，淬灭基团选自TAMRA、BHQ1或BHQ2。
[0037]在本专利技术的一具体实施例中，淬灭基团为BHQ1。
[0038]在上述引物和探针组合下，一方面，内参菌与尖孢镰刀菌萎蔫专化型具有一致的扩增引物，可保证扩增效率的一致；另一方面，上述探针仅能检测到本专利技术的基因片段、重组载体、重组细胞或内参菌，使得本专利技术内参菌可起到校正作用，消除各种因素造成的检测偏差。
[0039]本专利技术还提供了一种校正尖孢镰刀菌萎蔫专化型定量检测结果的方法，包括如下步骤：
[0040]在检测样品中加入已知量的上述内参菌，提取检测样品中总DNA，并分别对内参菌
和尖孢镰刀菌萎蔫专化型DNA进行定量分析，分别得到内参菌DNA和尖孢镰刀菌萎蔫专化型DNA的检出量；
[0041]根据内参菌DNA的检出量和添加量，得到内参菌DNA的回收效率；
[0042]根据内参菌DNA的回收效率和尖孢镰刀菌萎蔫专化型DNA的检出量，得到校正后的尖孢镰刀菌萎蔫专化型在检测样品中的含量。
[0043]作为优选，对内参菌DNA进行定量分析的引物和探针包括如SEQ ID NO：1所示的正向引物、如SEQ ID NO：2所示的反向引物、如SEQ ID NO：10所示的探针。该探针仅能检测到内参菌中的特异片段。
[0044]在本专利技术提供的具体实施例中，尖孢镰刀菌萎蔫专化型的定量分析试剂包括如下引物和探针：
[0045]如SEQ ID NO：1所示的正向引物；
[0046]如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
[0047]如SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因片段，其特征在于，所述基因片段包括正向引物序列、绿色荧光蛋白基因截短序列、第一卡那霉素抗性基因截短序列、第二卡那霉素抗性基因截短序列、反向引物序列；所述正向引物序列和/或所述反向引物序列对应于尖孢镰刀菌萎蔫专化型检测引物序列。2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于，所述绿色荧光蛋白基因截短序列如SEQ ID NO：6所示；所述第一卡那霉素抗性基因截短序列如SEQ ID NO：7所示；所述第二卡那霉素抗性基因截短序列如SEQ ID NO：8所示。3.根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于，所述正向引物序列如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物序列如SEQ ID NO：9所示。4.根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于，所述第一卡那霉素抗性基因截短序列与所述第二卡那霉素抗性基因截短序列之间还包括连接序列；作为优选，所述连接序列包括SpeI酶切位点序列。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的基因片段，其特征在于，所述基因片段的序列如SEQ ID NO：5所示。6.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1
‑
5中任一项所述的基因片段；所述生物材料包括重组载体和...

【专利技术属性】
技术研发人员：董丽红，王培培，张家齐，梁芸，郭庆港，马平，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：