一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针及快速实时可视化监测细胞分化的方法。该荧光探针具有如式I所示的结构式，其中10≥m≥1，10≥n≥1，并且m，n均为整数。该荧光探针以1,8

【技术实现步骤摘要】
一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药分析领域，具体涉及一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针及快速实时可视化监测细胞分化的方法。

技术介绍

[0002]成骨细胞在维持骨代谢平衡中起重要作用，其中骨折愈合高度依赖成骨细胞增殖分化的活性。因此，成骨分化程度的检测和评价在骨科及相关疾病中非常重要。
[0003]目前已开发出多种成骨细胞分化检测方法用于临床和科学研究中观察成骨细胞分化程度，如免疫染色、定量实时聚合酶链反应和蛋白质印迹法等。此外，基于茜素红S染色的矿化量化是目前最常用的方法。然而，这些方法存在两个缺陷：1)检测速度慢：从成骨分化开始到成熟需要约三周时间，目前选择的生物标志物均为成骨细胞矿化过程中的标志物，无法快速判断细胞分化能力；2)损坏细胞，无法实现对细胞分化动态过程的实时可视化全面监测。
[0004]成骨细胞由骨髓间充质干细胞(MSCs，Mesenchymal Stem Cells)分化得来。锌离子在细胞分化中一直发挥着重要作用。在干细胞分化的早期阶段，细胞核内锌离子浓度特异性地瞬时增加1
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2倍，随后迅速下降至初始水平。研究发现锌离子的核内流可能与细胞分化早期对锌离子的代谢活动的高需求有关(J.Struct.Biol.,2006,155:2
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11)。已有研究证明人胚胎干细胞多能性丧失与核锌离子浓度增加直接相关(PLoS ONE,2010,5(8):e12308)。因此，干细胞分化能力与核锌离子浓度呈正相关。此外，在成骨细胞矿化过程细胞质内锌离子浓度呈现逐渐增加的趋势。成骨细胞分化过程中需要大量锌离子抑制乌头酸酶以增强柠檬酸盐在骨磷灰石中的积累和沉积，促进成骨细胞矿化(Bioact.Mater.,2020,5:1018
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1025)。另外，研究发现，高浓度锌离子可促进成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶活性增加(Biol.Trace.Elem.Res.,2013,154(2):234
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243)。综上所述，在MSCs诱导成骨细胞分化早期，锌离子主要集中在细胞核；在成骨细胞矿化过程中，锌离子主要集中在细胞质。因此，追踪细胞核质内锌离子的动态变化即可快速判断成骨细胞分化能力和分化状态。
[0005]目前，大多数痕量金属离子分析的标准方法不适合追踪细胞内锌离子的核质分布。例如，原子吸收光谱仪和电感耦合等离子体质谱仪虽然具有明显的实用性，但需要大量的细胞，并且只能粗略分离细胞成分，无法区分细胞核与细胞质内的锌离子浓度。近年来，荧光探针因其灵敏度高、选择性好、毒性小、易于操作等优点引起了人们的广泛关注。虽然近年来锌离子荧光探针出现了许多令人振奋的发展，但迄今为止具有细胞核膜通透性的锌离子荧光探针尚不多见。因此，开发具有细胞核膜通透性的锌离子荧光探针仍然是一项具有挑战性的任务。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针及快速实时可视化监测细胞分化的方法。本专利技术提供的锌离子荧光探针对锌离子具有高选择性、高灵敏度，并
具有良好细胞核膜通透性的特点，采用该锌离子荧光探针，对细胞分化过程中如成骨细胞分化过程中细胞核和细胞质内的锌离子进行定性定量以及实时可视化监测，通过监测细胞核和细胞质内锌离子动态变化，能够实现快速实时可视化监测成骨细胞的分化能力以及分化状态。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针，具有如式I所示的结构式：
[0009][0010]式I中，m≥1，n≥1，且m，n均为整数。
[0011]在上述技术方案中，如式I所示的细胞核膜通透性锌离子荧光探针是以1,8
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萘酰亚胺为荧光母体，酰胺
‑
二甲基吡啶胺为识别基团，二胺长链为探针细胞核膜通透性功能基团。调控二胺长链水溶性基团与萘酰亚胺疏水性基团之间的亲疏水平衡有利于荧光探针渗透两亲性膜结构，增强其细胞膜以及细胞核膜的通透性，相较于以脂溶性或低水溶性基团修饰的荧光探针结构，本专利技术荧光探针具有良好的细胞核膜通透性，为锌离子荧光探针在细胞水平检测锌离子创造条件。二胺长链中，优选地，m为1至10的任一整数，所述n为1至10的任一整数，更优选地，m为1至6的任一整数，所述n为1至6的任一整数。
[0012]本专利技术的第二方面，提供一种如式I所示细胞核膜通透性锌离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0013]1)将化合物II和化合物III进行反应，反应物经氢化反应，得化合物IV；
[0014][0015]2)将4
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氨基
‑
1,8
‑
萘酐和4
‑
二甲氨基吡啶溶于有机溶剂A中，在冰水浴下滴加氯乙酰氯后，室温下进行反应，得化合物V；
[0016][0017]3)将化合物V溶于有机溶剂B中，加入二甲基吡啶胺、N,N
‑
二异丙基乙胺和碘化钾，在氮气保护下进行回流反应，得化合物VI；
[0018]4)将化合物VI溶于有机溶剂C中，加入化合物IV后，进行回流反应，得式I所示化合物。
[0019]在上述技术方案中，在在步骤1)中，所述反应物在[Co]‑
催化剂和氨存在下进行氢化反应，所述化合物II、化合物III、[Co]‑
催化剂、氨的摩尔比为1：(1
‑
8)：(1
‑
4)：(20
‑
50)，优选为1：(2
‑
4)：(1
‑
2)：(30
‑
40)。
[0020]在上述技术方案中，在步骤2)中，所述有机溶剂A为二氯甲烷、四氢呋喃、乙醚中的至少一种，所述4
‑
氨基
‑
1,8
‑
萘酐、4
‑
二甲氨基吡啶、氯乙酰氯的摩尔比为1：(1
‑
6)：(1
‑
10)，优选为1：(1
‑
3)：(2
‑
5)。
[0021]在上述技术方案中，在步骤3)中，所述有机溶剂B为乙腈、甲醇、乙醇中的至少一种，所述化合物V、二甲基吡啶胺、N,N
‑
二异丙基乙胺、碘化钾的摩尔比为1：(1
‑
4)：(1
‑
10)：(1
‑
4)，优选为1：(1
‑
2)：(2
‑
5)：(1
‑
2)。
[0022]在上述技术方案中，在步骤4)中，所述有机溶剂C为乙醇、甲醇、乙腈中的至少一种，所述化合物VI、化合物IV的摩尔比为1：(1
‑
10)，优选为1：(3
‑
6)。
[0023]本专利技术的第三方面，提供如式I所示细胞核膜通透性锌离子荧光探针在检测锌离子中的应用以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞核膜通透性锌离子荧光探针，其特征在于，具有如式I所示的结构式：其中，m≥1，n≥1，且m，n均为整数。2.根据权利要求1所述的细胞核膜通透性锌离子荧光探针，其特征在于，所述m为1至10的任一整数，所述n为1至10的任一整数。3.权利要求1或2所述的细胞核膜通透性锌离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：1)将化合物II和化合物III进行加成反应，反应物经氢化反应，得化合物IV；2)将4
‑
氨基
‑
1,8
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萘酐和4
‑
二甲氨基吡啶溶于有机溶剂A中，在冰水浴下滴加氯乙酰氯后，室温下进行反应，得化合物V；3)将化合物V溶于有机溶剂B中，加入二甲基吡啶胺、N,N
‑
二异丙基乙胺和碘化钾，在氮气保护下进行回流反应，得化合物VI；4)将化合物VI溶于有机溶剂C中，加入化合物IV后，进行回流反应，得式I所示化合物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述反应物在[Co]
‑
催化剂和氨存在下进行氢化反应，所述化合物II、化合物III、[Co]
‑
催化剂、氨的摩尔比为1：(1
‑
8)：(1
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4)：(20
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50)。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述有机溶剂A为二氯甲烷、四氢呋喃、乙醚中的至少一种，所述4
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氨基
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1,8
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萘酐、4
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二甲氨基吡啶、氯乙酰氯的摩尔比为1：(1
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙世国，谢珍珍，赵志昊，邓喜玲，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：