融合蛋白合成的方法和产品技术

本发明专利技术提供了生产融合蛋白的方法，所述方法包括：a)将第一蛋白质与第二蛋白质在能够在所述蛋白质之间形成异肽键的条件下接触，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质每种包括肽连接体，其中所述肽连接体是肽连接体对，其反应以形成连接所述第一蛋白质至所述第二蛋白质以形成连接的蛋白质的异肽键；和b)将来自(a)的所述连接的蛋白质与第三蛋白质在能够在所述第三蛋白质和所述连接的蛋白质之间形成异肽键的条件下接触，其中所述第三蛋白质包括与来自(a)的连接的蛋白质中的进一步肽连接体反应的肽连接体，并且其中所述肽连接体是肽连接体对，其反应以形成连接所述第三蛋白质至所述连接的蛋白质以形成融合蛋白的异肽键，其中在(a)中使用的所述肽连接体对正交于在(b)中使用的肽连接体对。也提供了肽连接体和正交的所述连接体对在合成融合蛋白中的用途。也考虑包括所述连接体的重组蛋白、编码所述蛋白质和连接体的核酸分子、包括所述核酸分子的载体和包括所述载体和核酸分子的宿主细胞。包括所述载体和核酸分子的宿主细胞。包括所述载体和核酸分子的宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白合成的方法和产品
[0001]本申请是申请日2016年6月3日、申请号201680037511.8、专利技术名称为“融合蛋白合成的方法和产品”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及融合蛋白(即包括两种或更多种共价连接的蛋白质的聚合物，如下面所定义的)的合成(即生产、生成或装配)，并且具体地涉及使用反应以形成异肽键的正交的肽连接体对模块式(例如逐步)合成融合蛋白。本专利技术涉及提供用于合成融合蛋白——具体而言固相合成——的新方法。该方法可以有利地用于生产多种产品，包括融合蛋白，例如融合蛋白阵列。本专利技术也提供了肽连接体和正交的所述连接体对在合成融合蛋白中的用途。也提供了包括所述连接体的重组蛋白、编码所述蛋白和连接体的核酸分子、包括所述核酸分子的载体和包括所述载体和核酸分子的宿主细胞。也提供了包括所述重组多肽和/或核酸分子/载体的试剂盒。也考虑由本专利技术的方法获得的融合蛋白和包括所述融合蛋白的产品，例如阵列和文库。

技术介绍

[0003]生物学事件通常取决于多种蛋白质的协同活性并且复合体中蛋白质的精确排列影响和决定它们的功能。因而，以受控方式排列复合体中单独蛋白质的能力代表表征蛋白质功能中的有用工具。而且，缀合多种蛋白质以形成所谓的“融合蛋白”可以导致具有有用特征的分子。例如，簇集单一种类的蛋白质通常大大地增强了生物学信号，例如疫苗上的重复抗原结构。具有不同活性的簇集蛋白也可以导致具有改善活性的复合体，例如通过酶的底物引导(substrate channelling)。
[0004]但是，簇集不同种类的蛋白质成为精确的人造“融合蛋白”已经遇到了许多问题。例如，单独蛋白质或蛋白结构域可以基因地接合为一个长的开放阅读框，但是蛋白质合成中的错误和错折叠很快成为限制。可选方法已经集中于单独地表达蛋白质或蛋白结构域并且然后将这些“模块”或“单元”连接在一起。例如，方法已经集中于修饰蛋白质以包含良好表征的相互作用配偶体，比如生物素/抗生物素蛋白，从而使得蛋白质能够通过非共价相互作用形成复合体。其它方法依赖于蛋白质内的反应基团——具体而言半胱氨酸残基——以通过共价键即二硫键连接蛋白质。但是，即使最佳的非共价键或可逆共价键允许融合蛋白的重排。因此，现有方法是受限的，因为它们通常导致难以分离的融合蛋白的不明确的混合物和/或在多种环境下例如在还原条件下不稳定的融合蛋白。
[0005]用于合成融合蛋白的系统的重要特征包括独立于任何模板的所述融合蛋白内的单独蛋白(即模块、结构域或单元)与每种蛋白(即模块、结构域或单元)的简单表达之间的分子上限定的连接。对于每种反应具有近乎定量的产率从而最小化几个步骤之后的非均质(heterogeneous)产品的无意合成——其是混合物内不完整链的常见结果——也是高度期望的。对于单独模块也优选地是利用相对小的肽标记物而不是大的蛋白融合结构域进行修饰，以便于最小化对融合蛋白内的每种模块功能的破坏。但是，现有融合蛋白合成方法尚不
能够满足这些标准。
[0006]因而，对于用于合成融合蛋白的改善方法存在需要和期望，并且现在已经发现了形成异肽键以生成不可逆共价键的肽连接体可以被用在用于合成融合蛋白的模块式(例如逐步)和高产率方法中。
[0007]异肽键是在羧基/甲酰胺和氨基之间形成的酰胺键，其中羧基或氨基中的至少一种在蛋白主链(蛋白质的骨架)的外部。这些键在生物学条件下是化学不可逆的并且它们对大多数蛋白酶具有抗性。事实上，蛋白质之间的异肽键已经被确定为测量的最强蛋白相互作用。
[0008]异肽键形成可以是酶催化的，例如通过转谷氨酰胺酶。通常在自然环境中发现异肽键改善蛋白质复合物的强度和/或稳定性，例如细胞外基质结构的稳定或血凝块的增强。
[0009]异肽键也可以自发形成，如在HK97噬菌体衣壳形成和革兰氏阳性细菌菌毛中已经鉴定的。已经提出了自发的异肽键形成在蛋白质折叠之后发生，这通过来自赖氨酸的ε
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氨基亲核攻击来自天冬酰胺或天冬氨酸的Cγ基团进行——其由附近的谷氨酸或天冬氨酸促进。
[0010]能够自发异肽键形成的蛋白质已经有利地用于研发肽标记物/结合配偶体对，其已经共价地彼此结合并且其因此提供了不可逆的相互作用(参见例如WO2011/098772，其通过引用被并入本文)。在这方面，能够自发异肽键形成的蛋白质可以表达为分开的片段，以产生肽标记物和肽标记物的结合配偶体，其中两个片段能够通过异肽键形成而共价重构。通过肽标记物和结合配偶体对形成的异肽键在下列条件下是稳定的：其中非共价相互作用将快速解离，例如在长时间段内(例如数周)、在高温下(到至少95℃)、在高的力(high force)下或者利用严苛的化学处理(例如，pH 2
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11、有机溶剂、洗涤剂或变性剂)。
[0011]简言之，肽标记物/结合配偶体对可以衍生自能够自发形成异肽键的任何蛋白质(异肽蛋白)，其中蛋白质的结构域分开地表达以产生肽标记物和肽结合配偶体，该肽标记物包括参与异肽键的残基中的一种(例如赖氨酸)，该肽结合配偶体包括参与异肽键的另一种残基(例如天冬酰胺或天冬氨酸)。在一些情况下，肽标记物或结合配偶体中的一种包括形成异肽键需要的一种或多种其它残基(例如谷氨酸)。但是，已经发现，分开表达包括参与异肽键形成的残基的结构域，即作为三种分开的肽(结构域、模块或单元)是可能的。在这方面，肽标记物包括参与异肽键的残基中的一种(例如赖氨酸)，肽结合配偶体包括参与异肽键的另一种残基(例如天冬酰胺或天冬氨酸)并且第三肽包括参与异肽键形成的一种或多种其它残基(例如谷氨酸)。将所有三种肽混合导致在包括反应以形成异肽键的残基的两种肽，即肽标记物和结合配偶体之间形成异肽键。因此，第三肽介导肽标记物和结合配偶体的缀合但是不形成部分得到的结构，即第三肽不共价连接至肽标记物或结合配偶体。因此，第三肽可以被视为蛋白连接酶或肽连接酶。这是特别有用的，因为它使需要被融合至感兴趣蛋白质的肽标记物和结合配偶体的大小最小化，从而降低由肽标记物或结合配偶体的添加引起的不需要的相互作用的可能性，例如错折叠。
[0012]如在下面更详细讨论的，能够自发形成一个或多个异肽键的各种蛋白质(所谓的“异肽蛋白”)已经被鉴定并且可以被修饰以产生肽标记物/结合配偶体对和任选地肽连接酶，如上面所讨论的。能够自发形成一个或多个异肽键的进一步蛋白质可以通过将它们的结构与已知自发形成一个或多个异肽键的蛋白质的结构进行比较来鉴定。具体地，可以自
发形成异肽键的其它蛋白质可以通过将它们的晶体结构与来自已知异肽蛋白例如主要菌毛蛋白Spy0128的晶体结构进行比较，并且具体而言将通常比较参与异肽蛋白形成的Lys
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Asn/Asp
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Glu/Asp残基来鉴定。另外地，其它异肽蛋白可以通过使用蛋白质数据库利用标准数据库检索工具筛选已知异肽蛋白的结构同源性来鉴定。SPASM服务器(http://eds.bmc.uu.se/eds/spana.php？spasm)可以被用于靶向异肽键的Lys<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生产融合蛋白的方法，所述方法包括：a)将第一蛋白质与第二蛋白质在能够在所述蛋白质之间形成异肽键的条件下接触，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质每种包括肽连接体，其中所述肽连接体是肽连接体对，其反应以形成连接所述第一蛋白质至所述第二蛋白质以形成连接的蛋白质的异肽键；和b)将来自(a)的所述连接的蛋白质与第三蛋白质在能够在所述第三蛋白质和所述连接的蛋白质之间形成异肽键的条件下接触，其中所述第三蛋白质包括与来自(a)的所述连接的蛋白质中的进一步肽连接体反应的肽连接体，并且其中所述肽连接体是肽连接体对，其反应以形成连接所述第三蛋白质至所述连接的蛋白质以形成融合蛋白的异肽键，其中在(a)中使用的所述肽连接体对正交于在(b)中使用的所述肽连接体对。2.权利要求1所述的方法，其为生产融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括第一肽连接体的第一蛋白质；b)将所述第一蛋白质与第二蛋白质在能够使得所述第一肽连接体和第二肽连接体形成异肽键的条件下接触，从而连接所述第一蛋白质和第二蛋白质，其中所述第二蛋白质包括所述第二肽连接体和第三肽连接体；和c)将所述连接的第一蛋白质和第二蛋白质与第三蛋白质在能够使得所述第三肽连接体和第四肽连接体形成异肽键的条件下接触，从而连接所述第二蛋白质和第三蛋白质以产生融合蛋白，其中所述第三蛋白质包括所述第四肽连接体，其中所述第一肽连接体和第二肽连接体是肽连接体对，其正交于由所述第三肽连接体和第四肽连接体组成的肽连接体对。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括延伸所述融合蛋白的步骤，其中待与所述融合蛋白连接的新蛋白质包括形成肽连接体对的一部分的肽连接体，所述肽连接体对正交于用于形成所述融合蛋白中的先前异肽键的肽连接体对，其中所述新蛋白质中的肽连接体能够与所述融合蛋白的蛋白质中的肽连接体形成异肽键，所述方法包括在能够使所述新蛋白质与所述融合蛋白中的肽连接体形成异肽键的条件下使所述新蛋白质与所述融合蛋白接触。4.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白具有分支、线性或环状结构。5.权利要求4所述的方法，其中所述融合蛋白是可环化的。6.权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述肽连接体之间的所述异肽键形成是自发的。7.权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述肽连接体之间的所述异肽键形成由添加至反应的组分诱导。8.权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述肽连接体对的每个衍生自异肽蛋白。9.权利要求8所述的方法，其中每个肽连接体对衍生自不同的异肽蛋白。10.权利要求8或9所述的方法，其中所述异肽蛋白包括如在SEQ ID NO:21、23、25、27、29或31的任一个中陈述的氨基酸序列或与如在SEQ ID NO:21、23、25、27、29或31的任一个中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质。11.权利要求7
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10中任一项所述的方法，其中诱导所述肽连接体之间的异肽键形成的组分是肽连接酶，优选地其中所述肽连接酶包括诱导所述肽连接体之间的异肽键形成的谷
氨酸或天冬氨酸残基。12.权利要求11所述的方法，其中所述肽连接酶衍生自异肽蛋白，优选地其中所述肽连接酶衍生自与诱导异肽键形成的肽连接体对相同的异肽蛋白。13.权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中所述肽连接体中的一个或多个包括封闭基团。14.权利要求13所述的方法，其中所述封闭基团阻止关联肽连接体对之间的异肽键形成。15.权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中肽连接体对中的每个肽连接体包括至少6个氨基酸。16.权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中每对中的一个肽连接体包括6
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50个氨基酸和所述对中的另一个肽连接体包括50
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300个氨基酸。17.权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中每对中的一个肽连接体包括赖氨酸残基和所述对中的另一个肽连接体包括天冬酰胺或天冬氨酸残基，其中所述残基参与异肽键的形成。18.权利要求11
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17中任一项所述的方法，其中所述肽连接酶包括50
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300个氨基酸。19.权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述正交的肽连接体对选自下列的任一种：(1)包括如在SEQ ID NO:1中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:1中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置9处的赖氨酸残基，和包括如在SEQ ID NO:2中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:2中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置55处的谷氨酸或天冬氨酸残基、在位置94处的苏氨酸残基、在位置100处的甘氨酸残基和在位置106处的天冬酰胺或天冬氨酸残基；(2)包括如在SEQ ID NO:5中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:5中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置8处的天冬氨酸或天冬酰胺残基，和包括如在SEQ ID NO:6中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ IDNO:6中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置8处的赖氨酸残基；(3)包括如在SEQ ID NO:9中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:9中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置17处的天冬酰胺或天冬氨酸残基，和包括如在SEQ ID NO:10中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:10中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置9处的赖氨酸残基和在位置70处的谷氨酸或天冬氨酸残基；(4)包括如在SEQ ID NO:109中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:109中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置17处的天冬酰胺或天冬氨酸残基、在位置11处的甘氨酸残基和任选地在位置20处的异亮氨酸残基、在位置21和22处的脯氨酸残基和在位置23处的赖氨酸残基，和包括如在SEQ ID NO:10中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:10中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置9处的赖氨酸残基和在位置
70处的谷氨酸或天冬氨酸残基；(5)包括如在SEQ ID NO:13中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:13中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置7处的天冬氨酸或天冬酰胺残基，和包括如在SEQ ID NO:14中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:14中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置56处的谷氨酸或天冬氨酸残基和在位置10处的赖氨酸残基；(6)包括如在SEQ ID NO:13中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:13中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置7处的天冬氨酸或天冬酰胺残基，和包括如在SEQ ID NO:33中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:33中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置8处的赖氨酸残基；和(7)包括如在SEQ ID NO:17中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:17中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置11处的天冬氨酸或天冬酰胺残基，和包括如在SEQ ID NO:18中陈述的氨基酸序列或者与如在SEQ ID NO:18中陈述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列的肽连接体，其中所述氨基酸序列包括在位置241处的谷氨酸或天冬氨酸残基和在位置162处的赖氨酸残基。20.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：牛津大学创新有限公司，
类型：发明
国别省市：