一种提高GLP-1Fc融合蛋白产量的方法技术

本发明专利技术提供一种提高GLP

【技术实现步骤摘要】
一种提高GLP
‑
1 Fc融合蛋白产量的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，本专利技术涉及一种提高GLP
‑
1 Fc融合蛋白产量的方法，特别涉及通过在CHO细胞中敲低medag基因揭示该基因与GLP
‑
1 Fc融合蛋白表达之间的密切关系，进而可以通过敲低medag基因达到提高GLP
‑
1 Fc融合蛋白的表达产量，在抗体相关的生物制药领域中具有较好的应用前景。

技术介绍

[0002]抗体类重组蛋白药物从出现至今凭借卓越的疗效、生物技术的快速发展以及研发投入的不断增加，已成为制药行业近年来发展最快的子行业，近70％的重组蛋白治疗产品都是在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中生产的，CHO细胞对蛋白质的修饰方式与人类细胞相似，因此，利用其生产的治疗性蛋白在临床使用时具有较高的生物活性，这使得CHO细胞在治疗性生物制药工业的发展中起着主导作用。由于哺乳动物细胞的生产周期长、成本高，致使抗体类药物价格高居不下，很多病人因无法负担高昂的费用而失去了最佳治疗时机。因此，为了扩大治疗群体，降低生产成本，大量研究均投入在如何进一步提高CHO细胞的重组蛋白产量上，具体方法包括提高细胞密度，优化表达载体和培养条件，以及对CHO细胞进行基因工程改造等，均取得了明显成效。在过去的几十年中，使用CHO细胞的工业化生产产量从最初的仅约100mg/L，达到后来的克级甚至十几克每升，产量增长上百倍之多。即使如此，仍难满足庞大的市场需求，需要更多能够提高CHO细胞重组蛋白表达的方法和技术。

技术实现思路

[0003]本专利技术主要提供了一种在CHO细胞中提高GLP
‑
1 Fc融合蛋白产量的方法，即通过敲低细胞内源性medag基因来获得。该基因所编码的蛋白为肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白(mesenteric estrogen
‑
dependent adipogenesis protein)。该蛋白与脂肪细胞的分化、脂肪的积累及葡萄糖摄取相关，但在本说明书中首次发现其在CHO细胞中的敲低可以显著增加GLP
‑
1 Fc融合蛋白的产量，为CHO细胞的基因工程改造提出了新的方法。
[0004]具体地，本专利技术提供了以下方面：
[0005]本专利技术一方面涉及一种提高GLP
‑
1 Fc融合蛋白产量的方法，所述方法包括在CHO细胞中利用CRISPR
‑
Cas9敲低medag基因并得到该基因的低表达细胞株，所述medag基因编码肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白。GLP1
‑
Fc为胰高血糖素样肽1受体激动剂与抗体IgG的Fc融合蛋白。
[0006]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述低表达细胞株相比于未敲低medag基因的原始细胞株，medag基因的表达降低20
‑
50％；优选降低25
‑
35％。将medag基因的表达降低到本专利技术的优选范围内，更有助于GLP
‑
1 Fc融合蛋白产量的提高。
[0007]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述medag基因序列如SEQ ID NO：1中所示。
[0008]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述medag基因通过含有针对该基因编码区的sgRNA质粒及编码Cas9的质粒共转染到CHO细胞中实现对基因medag的敲低。
[0009]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述方法包括利用qPCR与WB对筛选出的细胞株进行medag基因的mRNA表达水平及蛋白表达水平的检测。
[0010]本专利技术另一方面涉及一种CHO细胞，所述CHO细胞低表达medag基因，所述medag基因编码肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白。
[0011]本专利技术另一方面还涉及上述CHO细胞在提高重组蛋白的产量中的应用。
[0012]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述重组蛋白是GLP
‑
1 Fc融合蛋白。
[0013]本专利技术的技术效果
[0014]通过将细胞本身表达的内源性medag基因敲低后，CHO细胞中的重组蛋白表达量明显上升，提示该基因的表达水平与重组蛋白表达量间的高度相关性，因此可以用于对CHO细胞的基因工程改造以便获得高产细胞株。
附图说明
[0015]图1显示了含有sgRNA的pUC19
‑
U6
‑
sgRNA质粒示意图。
[0016]图2显示了pUC19
‑
U6
‑
sgRNA质粒单酶切后的电泳图，条带位置与理论值大小相符。
[0017]图3显示了pCMV
‑
Cas9
‑
EGFP质粒示意图。
[0018]图4显示了对pCMV
‑
Cas9
‑
EGFP质粒进行双酶切后的电泳图，条带位置与理论值大小相符。
[0019]图5显示了琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性的结果图，电泳图上可见清晰的三条带，说明所提取的RNA完整性良好。
[0020]图6显示了RT
‑
qPCR反应条件。
[0021]图7显示了medag基因在敲低细胞株与对照细胞株中的mRNA相对表达量，可见目标基因在两敲低细胞株中的mRNA表达水平比对照细胞株降低约80％。
[0022]图8显示了敲低细胞株与对照细胞株中MEDAG蛋白的WB检测结果图。通过与对照细胞株CHO
‑
Ctr相比，目标蛋白在两CHO
‑
KD细胞株中的表达量均有明显降低，显示敲低成功。
[0023]图9显示了对图8的WB结果进行的灰度分析数据，与对照细胞株相比，MEDAG蛋白在两个敲低细胞株中的相对表达量降低幅度分别为29％与42％，进一步显示敲低成功。
[0024]图10显示了medag基因敲低细胞株与对照细胞株的补料培养生长结果，可见两敲低细胞株的最高活细胞密度均低于对照细胞株，但细胞活率随培养时间的下降速度明显减慢，即延长了收料时间。
[0025]图11显示了medag基因敲低细胞株与对照细胞株的补料培养中重组蛋白产量结果，两敲低细胞株的产量均比对照细胞株的终产量具有大幅升高，分别增加132％和121％。
[0026]图12显示了p3.1
‑
EGFP
‑
PuroR
‑
medag的质粒示意图。
[0027]图13显示了p3.1
‑
EGFP
‑
PuroR的质粒示意图。
[0028]图14显示了对质粒p3.1
‑
EGFP
‑
PuroR
‑
medag和p3.1
‑
EGFP
‑
PuroR进行单酶切后的电泳图，条带位置与理论值大小相符，通过与未插入基因medag本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高GLP
‑
1Fc融合蛋白产量的方法，其特征在于：所述方法包括在CHO细胞中敲低medag基因并得到稳定低表达该基因的细胞株，所述medag基因编码肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，所述低表达细胞株相比于未敲低medag基因的原始细胞株，medag基因的表达降低20
‑
50％。3.根据权利要求1所述的方法，所述低表达细胞株相比于未敲低medag基因的原始细胞株，medag基因的表达降低25
‑
35％。4.根据权利要求1
‑
3任意一项所述的方法，其特征在于：所述medag基因序列如SEQ ID NO：1中所示。5.根据权利要求4所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓楠，马宁宁，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：