用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组及方法，第一引物对的上游引物如SEQ ID No:1所示，第一引物对的下游引物如SEQ ID No:2所示，第一探针如SEQ ID No:3所示；第二引物对的上游引物如SEQ ID No:4所示，第二引物对的下游引物如SEQ IDNo:5所示，第二探针如SEQ ID No:6所示；第三引物对的上游引物如SEQ IDNo:7所示，第三引物对的下游引物如SEQ ID No:8所示，第三探针如SEQ IDNo:9所示。实现了具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，为对应检测提供了特异、高效、敏感的技术手段的效果。敏感的技术手段的效果。敏感的技术手段的效果。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组及方法


[0001]本专利技术涉及病毒分子生物学检测领域，具体地，涉及用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组及方法。

技术介绍

[0002]鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)病毒感染雏鸭引起1
‑
4周龄雏鸭严重发病和死亡的传染病，引起雏鸭的肝脏损伤和炎症。本病最早发生于美国(1950)，后来在英国、加拿大、德国、意大利、印度、法国、俄罗斯、匈牙利、日本等国家陆续报道了该病的流行情况。鸭肝炎病毒曾被分为三个血清型，即：血清1型鸭肝炎病毒，血清2型鸭肝炎病毒和血清3型鸭肝炎病毒。其中，血清1型鸭肝炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)。DHAV暂时被分为3个基因型，即1型、2型和3型。
[0003]鸭病毒性肝炎所引起的鸭肝炎发病急，传播迅速，病程短，病死率高。其临床症状通常表现为角弓反张，运动失调，精神萎顿，身体倒向一侧，厌食，以头触地。病理变化表现为肝肿大和出血性斑点。DHAV
‑
1和DHAV
‑
3在中国地区流行广泛，其临床鉴别难以通过肉眼观察判断，对其预防控制带来了极大的困难，对养鸭产业造成了巨大的影响。
[0004]DHAV
‑
>1代表传统的流行毒株，全球范围内广泛流行，也是我国鸭肝炎病毒的主要流行毒株。DHAV
‑
3代表近年来我国和韩国等国家和地区新出现的流行毒株。该2个基因型病毒所引起的疾病在临床症状、病理变化上较为相似，给鉴别诊断带来很大的困难。
[0005]新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)是由一种有别于番鸭呼肠孤病毒的新型鸭源病毒引起的，可引起番鸭、半番鸭、麻鸭和北京鸭等水禽发病，临床上表现为肝脏不规则块状或斑状坏死、出血性混杂、法氏囊出血以及脾脏不同程度坏死为特征的新疫病，命名为“新肝病”或“鸭出血性坏死性肝炎”。研究表明，该病是由一种RNA病毒引起的，该病毒分类为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型呼肠孤病毒。由于呼肠孤病毒的基因组属于多节段RNA，容易发生基因突变，出现新的致病毒株可能性大大增加，给水禽养殖业带来新的危害。
[0006]目前国内外报道较多的主要是针对DHAV
‑
1进行检测，对DHAV
‑
1、DHAV
‑
3以及NDRV进行鉴别检测方法并不多见，尤其是实时荧光定量PCR方法鉴别检测DHAV
‑
1、DHAV
‑
3与NDRV鲜有报道。进一步地，由于上述三种病毒导致的症状通过肉眼直观鉴别并不明显，对此，也难以针对性去采用对应的病毒的鉴别方式进行检测，而分次检测又会造成鉴别成本的大大增加。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题，从而提供一种能够在同一体系中同时鉴别检测1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒，且具有良好的灵敏性、重复性、特异
性以及稳定性，为相应病原的检测和流行病学调查提供特异、高效、敏感的技术手段的用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组及方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对和第一探针，第二引物对和第二探针，以及第三引物对和第三探针；其中，
[0009]所述第一引物对的上游引物如SEQ ID No:1所示，所述第一引物对的下游引物如SEQ ID No:2所示，所述第一探针如SEQ ID No:3所示；
[0010]所述第二引物对的上游引物如SEQ ID No:4所示，所述第二引物对的下游引物如SEQ ID No:5所示，所述第二探针如SEQ ID No:6所示；
[0011]所述第三引物对的上游引物如SEQ ID No:7所示，所述第三引物对的下游引物如SEQ ID No:8所示，所述第三探针如SEQ ID No:9所示。
[0012]优选地，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的5
’
端结合有荧光报告基团，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的3
’
端结合有荧光猝灭基团；且，
[0013]所述荧光报告基团选自FAM、TET、NED、JOE、HEX和VIC中的一种或多种。
[0014]优选地，所述第一探针上结合的荧光报告基团为FAM，所述第二探针上结合的荧光报告基团为VIC，所述第三探针上结合的荧光报告基团为NED；
[0015]所述第一探针和所述第二探针上结合的荧光猝灭基团为BHQ1，所述第三探针上结合的荧光猝灭基团为BHQ2。
[0016]本专利技术还提供了一种用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的方法，采用根据上述所述的用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组。
[0017]优选地，所述方法包括：采用引物探针组对待测样品的核酸样本进行荧光扩增；根据荧光扩增结果判定待测样品中是否含有1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒中的一种或多种。
[0018]优选地，荧光扩增过程的退火温度为58
‑
61℃；
[0019]引物探针组中每条引物的用量为0.4
‑
0.8μL。
[0020]优选地，所述检测方法为定量检测，所述检测方法还包括：
[0021]S100、制备阳性标准质粒；
[0022]S200、对制备的阳性标准质粒按梯度进行稀释后，获得多梯度的参比样本；
[0023]S300、对得到的多个所述参比样本分别采用引物探针组进行荧光扩增，并测定对应的Ct值；
[0024]S400、以每个所述参比样本的病毒拷贝数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标，构建病毒拷贝数
‑
Ct标准曲线；
[0025]S500、基于构建的病毒拷贝数
‑
Ct标准曲线，根据待测样品中测得的Ct值对应获得待测样品的病毒拷贝数。
[0026]优选地，1型鸭肝炎病毒的线性关系方程为Y＝
‑
3.20X+43.724；
[0027]3型鸭肝炎病毒的线性关系方程为Y＝
‑
3.343X+42.401；
[0028]新型鸭呼肠孤病毒的线性关系方程为Y＝
‑
3.243X+43.309；其中，
[0029]Y为Ct值，X为病毒拷贝数。
[0030]本专利技术建立的用于1型和3型鸭肝炎病毒与新型呼肠孤病毒的三重荧光定量检测
方法可以同时检测和鉴别上述三种病毒，具有操作简单、敏感性高、特异性强、重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括第一引物对和第一探针，第二引物对和第二探针，以及第三引物对和第三探针；其中，所述第一引物对的上游引物如SEQ ID No:1所示，所述第一引物对的下游引物如SEQ ID No:2所示，所述第一探针如SEQ ID No:3所示；所述第二引物对的上游引物如SEQ ID No:4所示，所述第二引物对的下游引物如SEQ ID No:5所示，所述第二探针如SEQ ID No:6所示；所述第三引物对的上游引物如SEQ ID No:7所示，所述第三引物对的下游引物如SEQ ID No:8所示，所述第三探针如SEQ ID No:9所示。2.根据权利要求1所述的用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的5
’
端结合有荧光报告基团，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的3
’
端结合有荧光猝灭基团；且，所述荧光报告基团选自FAM、TET、NED、JOE、HEX和VIC中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的引物探针组，其特征在于，所述第一探针上结合的荧光报告基团为FAM，所述第二探针上结合的荧光报告基团为VIC，所述第三探针上结合的荧光报告基团为NED；所述第一探针和所述第二探针上结合的荧光猝灭基团为BHQ1，所述第三探针上结合的荧光猝灭基团为BHQ2。4.一种用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，采用根据权利要求1
‑
3中任意一项所述的用于鉴定1型和3型鸭肝炎病毒与新型鸭呼肠孤...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴双，袁慧莎，朱善元，林梦舟，吴植，张聪，王安平，谢军，刘莉，姜勇，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：