本发明专利技术公开了一种对存在聚合体结构的蛋白质采用甘氨酸酸性缓冲液进行酸处理，使之成为游离单体抗原，并以单体抗原为免疫原免疫动物制备针对蛋白线性表位的单体型抗体的方法，使用这种抗体能提高免疫学定量检测聚合体结构蛋白的准确性。以本发明专利技术方法制备的小鼠抗人促血管生成素２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ａｎｇ２）单体型单抗，生产的化学发光免疫定量检测试剂，检测的灵敏度达到５０ｐｇ／ｍｌ，定量线性范围在５０ｐｇ／ｍｌ－１２ｎｇ／ｍｌ，特异性强；生产的酶联免疫检测试剂，灵敏度达到６００ｐｇ／ｍｌ，定量线性范围在０．６ｎｇ／ｍｌ－１５ｎｇ／ｍｌ，特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种单体型抗体的制备及使用方法，尤其是涉及用酸性缓冲液处理以聚合体形式存在的蛋白，使之成为游离单体，并用单体抗原免疫动物获得单体型抗体，单体型抗体可用于单体抗原的定量检测。
技术介绍
自然界中存在着众多的蛋白质，蛋白质是组成生物有机体的重要组成部分，不同蛋白质行使着不同的生物学功能，而蛋白质的结构、构象是决定功能的基础，每一种蛋白质都必需以一定的构象存在才能发挥正常的生物学功能。 同样人体内存在的许多细胞因子，也必需以二聚体或多聚体的形式存在才能发挥正常的生物学功能，比如促进新生血管形成的促血管生成素2(Angiopoietins，Ang2)，它在血管重塑部位和血管丰富的肿瘤组织中是以多聚体的形式与内皮细胞表面的受体结合，激活靶细胞内的信号转导途径，剌激新生血管的形成。如由巨噬细胞和B细胞产生的IL-12,在体内是以异源二聚体的形式，来促进T细胞和NK的增殖与杀瘤作用、诱导IFN-y等多种细胞因子的产生及调节Thl细胞发育等功能。这些细胞因子由于在体内有着重要的生物学功能，其浓度的变化往往伴随着机体的生理和病理状态的改变，因此，定量检测这些以二聚体或多聚体形式存在的蛋白，可用于疾病的检测、诊断和科研领域。 但是，这种复杂的二聚体或多聚体的空间构象却给蛋白的定量检测带来了困难。目前常用的细胞因子定量检测方法就是基于抗原抗体特异结合活性的免疫学检测方法，即在一定的反应条件下，加入一定浓度的已知抗体，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原的量成正比，当抗体浓度一定时，免疫复合物越多反应样品中的抗原量也越多，再用实验性标准曲线就可推算出样品中抗原的含量，而抗原抗体以l : l的比例结合是准确定量推算的基础。可是，如果用免疫学方法去检测上述二聚体或多聚体的蛋白，空间构象的存在影响了抗原抗体的结合，使抗原抗体的结合比例不能达到i : i，从而影响了定量检测的准确性。 首先，存在于被检物如血液或体液中的，二聚体或多聚体蛋白的空间构象位阻会影响抗原与抗体的结合，从而降低检测的灵敏度和准确性。其次，蛋白的抗原表位可能会被蛋白的空间结构所屏蔽，抗体不能识别和结合抗原，从而降低了检测的灵敏度和准确性。最后也就是最重要的一点，如果以生理性的聚合体蛋白为免疫原免疫动物制备抗体，得到的往往是空间构象抗体，这种抗体是在将二聚体或多聚体蛋白作为一个分子的基础上产生的，与真正的能识别单分子抗原表位的抗体不一样，它所识别的是在二聚体或多聚体空间结构的基础上所形成的新的不正确的抗原表位，而这种所谓的抗原表位在体内会随着蛋白的聚合和解离而消失和发生变化，非常不稳定。因此以这种空间构象抗体作为检测试剂，对抗原进行定量检测会出现较大偏差。 本专利技术就是为了解决上述二聚体或多聚体蛋白定量检测中存在的缺陷而设计和实施的，本专利技术从引起检测误差产生的根本性问题入手，即二聚体或多聚体结构的空间构象是产生问题的根源，去除蛋白的空间构象，使蛋白成为单体抗原，并以单体抗原为免疫原制备针对单体抗原线性表位的单体型抗体，以单体型抗体作为检测试剂去检测样品中被处理过的已成为单体抗原的待检蛋白，使抗原抗体的结合比例达到i : i，从而大大提高免检学检测的灵敏度和准确性。 本专利技术一方面针对多聚体蛋白质，提供了一种单体型抗体的制备方法即用酸性缓冲液处理多聚体蛋白质，使之成为单体抗原，以单体抗原为免疫原免疫动物制备单体型抗体。其中所述酸性缓冲液为含有甘氨酸、柠檬酸、乙酸的酸性缓冲液，优选甘氨酸酸性缓冲液；所述多聚体蛋白为促血管生成素2(Angiopoietins，Ang2)等类似结构的蛋白。 本专利技术另一方面提供了一种单体型抗体的使用方法，将待测样品用酸性缓冲液处理，使其中待测的多聚体蛋白质成为单体抗原，与前述的制备方法得到的单体型抗体进行免疫反应，来检测待测的多聚体蛋白质的含量。其中所述酸性缓冲液为含有甘氨酸、柠檬酸、乙酸的酸性缓冲液，优选甘氨酸酸性缓冲液。所述多聚体蛋白为Ang2等类似结构蛋白。 利用本专利技术方法制备的Ang2单体型抗体，并结合本专利技术所涉及的被检二聚体或多聚体抗原预处理方法，可提高多种免疫学检测方法的灵敏度和准确性。小鼠抗人Ang2单体型单抗可使人Ang2增强化学发光检测分析(CLIA)的灵敏度从0. 3ng/ml提高到50pg/ml，定量线性范围在50pg/ml-12ng/ml，特异性强，与人血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、血红蛋白、层粘蛋白、C反应蛋白、Angl、糖类抗原CA125、APF、CEA及其它肿瘤标志物不发生交叉反应，批内变异系数(CV)小于15X、批间CV值小于18%。 小鼠抗人Ang2单体型单抗可使人Ang2酶联免疫分析(ELISA)的灵敏度从lng/ml提高到0. 6ng/ml ;定量线性范围在0. 6ng/ml-15ng/ml ;特异性不变，与人血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、血红蛋白、层粘蛋白C反应蛋白、Angl、糖类抗原CA125、APF、CEA及其它肿瘤标志物不发生交叉反应。 本专利技术的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本专利技术的具体实施方式之后将变得显而易见。附图说明 图1.用小鼠抗人Ang-2单体型单抗制备的增强化发光免疫定量检测试剂的标准曲线示意图。 图2.用小鼠抗Ang-2单克隆抗体制备的增强化发光免疫定量检测试剂的标准曲线示意图。 图3.抗Ang-2单体型单抗与抗Ang-2单克隆抗体制备的增强化学发光定量检测试剂标准曲线示意图的比较。具体实施例方式本专利技术的单体型抗体的制备方法具体包括以下步骤 (1)单体抗原的制备将多聚体蛋白溶解于酸性缓冲液中，破坏聚合体结构，使之游离成为线性单体抗原。(2)免疫动物取一定量的单体抗原溶液与等体积的福氏完全佐剂完全混合，皮4下多点注射小鼠、大鼠、兔子、羊等动物。与等体积的福氏不完全佐剂混合进行加强免疫。(3)收集动物血清，测定抗体效价，为所制备的单体型多克隆抗体。 (4)细胞融合将免疫Babl/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0进行融合。 (5)筛选克隆有限稀释法分离抗体，用间接ELISA法鉴定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞。 (6)亚克隆制备将阳性克隆用半固体培养基培养，ELISA检测阳性克隆。 (7)单体型单抗性能鉴定用间接ELISA和Western blotting检测抗体特异性，用分型抗体鉴定抗体亚型，ELISA法测定抗体的效价和特异性。 (8)阳性单抗的大规模制备，制备腹水并用辛酸一硫酸铵方法纯化抗体。 结合增强化学发光酶联免疫分析方法，来说明本专利技术的单体型单抗在定量检测方面的优越性，具体来说包括以下步骤 (1)标记单体型单抗用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记到单体型单抗上。 (2)抗体配对先用抗体粗配对实验挑选效果比较好的几株抗体，再用精确配对 实验选取读数值最高的一对抗体，作为检测使用。 (3)反应条件的优化和确立包括抗体的检测和包被浓度的确定、洗涤强度的确 定、标准曲线的制作、特异性分析和精密度的测定等。 (4)待测样品的处理用酸性缓冲液稀释样品，使其中待测的多聚体蛋白质成为 单体抗原。 (5)反应测定将单体抗原与单体型单抗混合反应，加入含有发光增强剂的化学 发光底物作用，用化学发光免疫分析仪测量发光值，计算抗原浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单体型抗体的制备方法，其特征在于：用酸性缓冲液处理多聚体蛋白质，使之成为单体抗原，以单体抗原为免疫原免疫动物制备单体型抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王虹，
申请(专利权)人：广东虹业抗体科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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