本发明专利技术公开了一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，该应用通过昆虫病毒FHV RNA1复制子的自主复制能力在mRNA水平上进行外源基因的扩增；本发明专利技术公开了上述基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统和该质粒系统的构建方法；本发明专利技术还公开了该质粒系统在细胞中表达蛋白的方法和应用，该质粒系统在双酶切后获得克隆载体，与外源基因进行同源重组后，在细胞中表达动物或植物蛋白。在细胞中表达动物或植物蛋白。在细胞中表达动物或植物蛋白。
【技术实现步骤摘要】
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统及其构建和应用
[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统及其构建和应用。
技术介绍
[0002]外源基因的功能和其调控机理，需要通过在宿主细胞中表达才能够进行进一步的研究。表达外源基因的的宿主细胞称为表达系统，分为原核系统和真核系统，其中真核系统包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳类动物细胞和植物细胞等。要使外源基因在宿主细胞中表达，需要将其插入带有基因表达所需的各种元件的表达载体中。对于不同的表达系统，则需要构建不同的表达载体。真核表达系统能够识别并且切除外源基因的内含子，同时真核表达系统对翻译水平的调节较好，且外源基因能够被糖基化，有利于保持免疫原性。
[0003]然而，真核表达系统中存在着外源基因导入真核细胞的效率较低的问题，真核表达载体无法持续复制以达到高拷贝数；且目前的真核表达载体存在界障，不同的真核细胞中并不能通用；另外，某些真核表达载体虽然能高效表达外源基因，但同时会对宿主细胞造成生理干扰或引起宿主死亡。
技术实现思路
[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，其能解决外源mRNA扩增能力弱的问题。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，其能解决载体低转录活性的问题。
[0006]本专利技术的第三个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其能解决具有高复制能力的真核表达载体构建的问题。
[0007]本专利技术的第四个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，其能解决真核表达载体无法持续复制，存在物种界障和干扰宿主细胞的问题。
[0008]本专利技术的第五个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的应用，其能解决真核表达载体在真核细胞中无法穿梭表达的问题。
[0009]本专利技术的第一个目的采用以下技术方案实现：
[0010]一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，所述复制子的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
[0011]进一步地，将外源基因插入所述昆虫病毒FHV RNA1复制子的3
’
端与B2编码序列之间的开放阅读框内以进行外源基因的扩增，所述B2编码序列包括如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
[0012]本专利技术的第二个目的采用以下技术方案实现：
[0013]一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，所述质粒系统应用昆虫病毒FHV RNA1复制子；所述质粒系统以pUC载体为骨架载体；所述质粒系统的核苷酸序列依次包括载体启动子、昆虫病毒FHV RNA1复制子、Linker序列、P2A序列、B2编码序列、HDV核酶序列、载体终止子。
[0014]进一步地，所述P2A序列与B2编码序列间包括酶切位点；所述酶切位点依次为PstI、EcoRI、XhoI、XbaI和HindIII；所述载体启动子为CMV启动子或T7启动子中的一种。
[0015]本专利技术的第三个目的采用以下技术方案实现：
[0016]一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017]步骤1、用引物和模版扩增多个所述质粒系统的核苷酸序列片段；步骤2、连接所述多个质粒系统的核苷酸序列片段，获得连接产物；步骤3、将所述连接产物转至大肠杆菌感受态细胞培养；步骤4、培养步骤3所述大肠杆菌感受态细胞，筛选后提取重组质粒，完成一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建。
[0018]进一步地，步骤1中，所述质粒系统的核苷酸序列片段扩增时以绿色荧光蛋白表达盒为模版，扩增得到片段A；以pUC
‑
T7
‑
FHVRNA1质粒为模版，分别扩增得到片段B和片段C；以CMV启动子为模版，扩增得到片段D；所述pUC
‑
T7
‑
FHVRNA1质粒的核苷酸序列如SEQNO.3所示；所述绿色荧光蛋白表达盒核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述CMV启动子核苷酸序列如SEQ NO.5所示。
[0019]进一步地，所述步骤1中，采用上游引物[pUC/PstI]‑
hibit
‑
fwd和下游引物msfGFP
‑
[pUC/XhoI]‑
rev扩增绿色荧光蛋白表达盒，得到片段A，上游引物[pUC/PstI]‑
hibit
‑
fwd核苷酸序列如SEQ NO.6所示，下游引物msfGFP
‑
[pUC/XhoI]‑
rev核苷酸序列如SEQ NO.7所示；采用上游引物FHV RNA1/1st
‑
fwd和下游引物[P2A/PstI]‑
rev以pUC
‑
T7
‑
FHVRNA1质粒为模版进行扩增，得到片段B，上游引物FHV RNA1/1st
‑
fwd核苷酸序列如SEQ NO.8所示，下游引物[P2A/PstI]‑
rev核苷酸序列如SEQ NO.9所示；采用上游引物[XhoI/B2]‑
fwd和下游引物pUC/last base
‑
rev以pUC
‑
T7
‑
FHVRNA1质粒为模版进行扩增，得到片段C，上游引物[XhoI/B2]‑
fwd核苷酸序列如SEQ NO.10所示，下游引物pUC/last base
‑
rev核苷酸序列如SEQ NO.11所示；采用上游引物pUC/CMV
‑
fwd和下游引物CMV/FHV RNA1
‑
ev扩增CMV启动子，得到片段D，上游引物pUC/CMV
‑
fwd核苷酸序列如SEQ NO.12所示，下游引物CMV/FHV RNA1
‑
rev核苷酸序列如SEQ NO.13所示。
[0020]本专利技术的第四个目的采用以下技术方案实现：
[0021]一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，包括以下步骤：对所述基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统进行双酶切，获得克隆载体；所述克隆载体与外源基因进行同源重组，获得同源重组产物；所述同源重组产物转染到宿主细胞中培养后，收取细胞样品并检测，完成蛋白的表达。
[0022]进一步地，所述双酶切的位点为PstI和XhoI。
[0023]本专利技术的第五个目的采用以下技术方案实现：
[0024]一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在蛋白表达中的应用。
[0025]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0026]1.本专利技术的一种用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，其特征在于，所述复制子的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。2.根据权利要求1所述一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，其特征在于，将外源基因插入所述昆虫病毒FHV RNA1复制子的3
’
端与B2编码序列之间的开放阅读框内以进行外源基因的扩增，所述B2编码序列包括如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。3.一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，应用权利要求1或2所述的昆虫病毒FHV RNA1复制子，其特征在于，所述质粒系统以pUC载体为骨架载体；所述质粒系统的核苷酸序列依次包括载体启动子、昆虫病毒FHV RNA1复制子、Linker序列、P2A序列、B2编码序列、HDV核酶序列、载体终止子。4.根据权利要求3所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，其特征在于，所述P2A序列与B2编码序列间包括酶切位点；所述酶切位点依次为PstI、EcoRI、XhoI、XbaI和HindIII；所述载体启动子为CMV启动子或T7启动子中的一种。5.权利要求3
‑
4任一项所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、用引物和模版扩增多个所述质粒系统的核苷酸序列片段；步骤2、连接所述多个质粒系统的核苷酸序列片段，获得连接产物；步骤3、将所述连接产物转至大肠杆菌感受态细胞培养；步骤4、培养步骤3所述大肠杆菌感受态细胞，筛选后提取重组质粒，完成一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建。6.根据权利要求5所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其特征在于，步骤1中，所述质粒系统的核苷酸序列片段扩增时以绿色荧光蛋白表达盒为模版，扩增得到片段A；以pUC
‑
T7
‑
FHVRNA1质粒为模版，分别扩增得到片段B和片段C；以CMV启动子为模版，扩增得到片段D；所述pUC
‑
T7
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FHVRNA1质粒的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；所述绿色荧光蛋白表达盒核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述CMV启动子核苷酸序列如SEQ NO.5所示。7.根据权利要求6所述一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其特征在于，所述步骤1中，采用上游引物[pUC/PstI]
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hibit
‑
fwd和下游引物msfGFP
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[pUC...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘定祥，魏玉琴，冯涛声，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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