一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术涉及一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法，所述试剂盒包括如下组件：蛋白酶k溶液、磁珠悬浮液、离心纯化柱、收集管、裂解结合液、亚硫酸盐转化液、脱磺液、洗涤液、洗脱液。本发明专利技术所述试剂盒灵活的将游离DNA的提取和转化过程合二为一，先富集转化，再纯化浓缩。如此既节省了转化游离DNA的时间，又可以避免在提取过程中游离DNA的损耗。因此，本发明专利技术所述方法具有成本低、操作简短、转化率及回收率高等优点，为后续的甲基化特异性PCR扩增、亚硫酸盐测序等实验提供了高纯度的样品。等实验提供了高纯度的样品。等实验提供了高纯度的样品。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及到一种用于血浆游离DNA甲基化检测的核酸提取纯化试剂盒及使用方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是人类最早发现的表观遗传现象之一。所谓表观遗传，是指在不改变基因原始序列的情况下，调控基因的表达，使基因发生可遗传的变化，并最终导致个体（细胞）的表型发生改变。也就是说，基因组中含有两类遗传信息，一类是传统意义上的遗传信息，即基因编码的遗传信息；另一类是表观遗传信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。从当前的研究来看，DNA甲基化、组蛋白印迹、非编码RNA等均属于表观遗传学的范畴。
[0003]DNA甲基化发生在DNA甲基转移酶的催化下，5
’‑
CpG
‑3’
位点中的胞嘧啶被选择性的添加上一个甲基，形成5
‑
甲基胞嘧啶。人基因的启动子区及第一个外显子区富含5
’‑
CpG
‑3’
位点，一旦它们发生甲基化，该基因的转录过程就会收到抑制。研究表明，抑癌基因甲基化水平的异常升高是肿瘤发生的早期事件之一，因此近年来，DNA甲基化检测在癌症早期筛查领域的研究相当活跃。例如，对Septin 9基因进行甲基化检测在2016年就被FDA批准用于结直肠癌患者的早期筛查。
[0004]血液中游离DNA作为理想的检测对象，上面携带了来自人体内部各种细胞的基因组DNA的遗传信息，其中就包含了DNA甲基化。因此，利用游离DNA进行甲基化检测，能够实现无创的癌症早期筛查，应用前景十分广阔。然而，检测DNA甲基化的方法虽多，但大都绕不开亚硫酸盐转化过程。该过程在高温、高盐的条件下进行，使得非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，以和甲基化胞嘧啶区分。恶劣的反应环境使得超过70%的游离DNA损失在这一步，而回收回来的BiscfDNA也“伤痕累累”，碎片化十分严重，导致后续的PCR检测过程无法进行。
[0005]市面上现有的产品并不能直接获得BiscfDNA，必须经过“裂解
→
吸附
→
三次纯化
→
洗脱”获得游离DNA之后，再经过“转化
→
吸附
→
纯化
→
脱磺
→
两次纯化
→
洗脱”才能获得BiscfDNA。前后两个过程不仅操作繁琐、耗费时间和试剂，而且无法完全衔接，徒增游离DNA的损失。更重要的是，后一过程还要使用到高速离心设备，不能够实现自动化。这些缺点无疑给甲基化检测的普及带来了困难。尽管专利CN107868813A、CN108265050A和CN112143778A分别从不同的角度尝试解决这些问题，但又引入了高成本，应用范围窄等缺点。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术的缺陷与不足，本专利技术公开了一种核酸提取纯化试剂盒，简化了操作流程，增加了游离DNA的转化率与回收率，在两小时以内便能分离出高质量BiscfDNA，有助于基于血液游离DNA甲基化检测的癌症早筛普及。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
一种核酸提取纯化试剂盒，所述试剂盒包括如下组件：蛋白酶k溶液、磁珠悬浮液、离心纯化柱、收集管、裂解结合液、亚硫酸盐转化液、脱磺液、洗涤液。
[0008]所述蛋白酶k溶液的浓度为15
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25mg/mL；优选为20mg/ml；所述磁珠为表面修饰有羟基的二氧化硅包被的Fe3O4颗粒，其粒径为100
‑
1000nm，磁珠悬浮液浓度为20
‑
100mg/ml；优选为粒径1000nm，30mg/ml；所述离心纯化柱为底部带有硅胶模吸附柱的1mL规格的带盖EP管；所述收集管为2 mL规格的无盖EP管；所述裂解结合液为Tris
‑
HCl、聚乙二醇、异丙醇、异硫氰酸胍、盐酸胍、NaCl、曲拉通X
‑
100、EDTA、柠檬酸钠、柠檬酸中的一种或几种组合，优选为Tris
‑
HCl、EDTA、异硫氰酸胍、异丙醇、曲拉通X
‑
100的混合液，更优选浓度为10mM/L，PH为5.0
‑
6.0的Tris
‑
HCl、EDTA、浓度为2
‑
6mol/L的异硫氰酸胍、体积分数分别为10%
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30%的异丙醇和10%
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50%的曲拉通X
‑
100的混合液；所述转化液为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢铵、氢氧化钠、对苯二酚中的一种或几种组合，优选浓度为3
‑
6mol/L，pH为4.5
‑
6.0的亚硫酸氢钠和浓度为20
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100mM/L的对苯二酚的混合溶液。
[0009]脱磺液为氢氧化钠的乙醇溶液，优选为10
‑
200mM/L NaOH的75%
‑
95%的乙醇溶液；所述洗涤液为75%
‑
95%的乙醇溶液，优选为80%；所述洗脱液为纯化水。
[0010]所述试剂盒适用于离体的人外周血血浆游离DNA甲基化检测的核酸提取纯化。
[0011]一种采用核酸提取纯化试剂盒进行核酸提取纯化的方法，包括如下步骤：（1）裂解结合：向血浆样品中加入蛋白酶k进行消化，同时加入超顺性纳米磁珠和裂解结合液进行游离DNA吸附；（2）洗脱转化：将步骤（1）中磁珠吸附的游离DNA洗脱下来，进行亚硫酸盐转化；（3）二次结合：往离心纯化柱中加入裂解结合液和转化完成的DNA溶液，吸附转化后的游离DNA（BiscfDNA）；（4）洗涤脱磺：向步骤（3）中离心柱吸附的BiscfDNA加入脱磺液，进行脱磺化；（5）洗涤纯化：对步骤（4）中脱磺化后的BiscfDNA进行洗涤纯化；（6）晾干洗脱：将步骤（5）中纯化后的BiscfDNA室温晾干，然后加入洗脱液，进行洗脱。
[0012]步骤（1）和步骤（3）中裂解结合液为Tris
‑
HCl、聚乙二醇、异丙醇、异硫氰酸胍、盐酸胍、NaCl、曲拉通X
‑
100、EDTA、柠檬酸钠、柠檬酸中的一种或几种组合，优选为Tris
‑
HCl、EDTA、异硫氰酸胍、异丙醇、曲拉通X
‑
100的混合液，更优选浓度为10mM/L，PH为5.0
‑
6.0的Tris
‑
HCl、EDTA、浓度为2
‑
6mol/L的异硫氰酸胍、体积分数分别为10%
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30%的异丙醇和10%
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50%的曲拉通X
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100的混合液；步骤（1）中裂解结合液与血浆的配比为1:1
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1.5；优选为1:1；步骤（2）中洗脱液与转化液的配比为1:0.5
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1:5，优选为1:1.667;步骤（1）中蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 裂解结合：向血浆样品中加入蛋白酶k进行消化，同时加入超顺性纳米磁珠和裂解结合液进行游离DNA吸附；(2) 洗脱转化：将步骤（1）中磁珠吸附的游离DNA洗脱下来，进行亚硫酸盐转化；(3) 二次结合：往离心纯化柱中加入裂解结合液和转化完成的DNA溶液，吸附转化后的游离DNA（BiscfDNA）；(4) 洗涤脱磺：向步骤（3）中离心柱吸附的BiscfDNA加入脱磺液，进行脱磺；(5) 洗涤纯化：对步骤（4）中脱磺化后的BiscfDNA进行洗涤纯化；(6) 晾干洗脱：将步骤（5）中纯化后的BiscfDNA室温晾干，然后进行洗脱。2.根据权利要求1所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（3）中裂解结合液为Tris
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HCl、聚乙二醇、异丙醇、异硫氰酸胍、盐酸胍、NaCl、曲拉通X
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100、EDTA、柠檬酸钠、柠檬酸中的一种或几种组合。3.根据权利要求1所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，步骤（2）中亚硫酸盐转化液为3
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6mol/L，pH为4.5
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6.0的亚硫酸氢钠和浓度为20
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100mM/L的对苯二酚的混合溶液。4.根据权利要求1所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，步骤（4）中脱磺液为10
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200mM/L NaOH的80%的乙醇溶液。5.根据权利要求1所述的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡子健，
申请(专利权)人：卡秋江苏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：